腺病毒介导EGFP基因转染神经干细胞

互联网2012-10-09

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神经干细胞（NSCS）是指一类具有多分化潜能（能分化为神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞），能自我更新和克隆性增殖的一群细胞。在NSCS移植研究中，有必要对NSCS进行示踪标记，以便实时跟踪和区分植入的NSCS和宿主细胞。

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因是一种新的报告基因，其表达产物GFP可在紫外光或蓝色光激发下稳定地发出绿色荧光，不需要任何底物或辅助因子。在GFP的基础上进行F64L和S65T突变后的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）进一步增强了GFP的荧光性能，使结果更容易观察检测。

本实验从新生SD大鼠海马组织中分离神经干细胞，并通过观察携带EGFP基因的腺病毒（Ad/ EGFP）转染NSCS后EGFP表达规律及转染对NSCS的活力、增殖、分化等的影响，探讨EGFP作为NSCS的示踪标志物的可行性，为进一步的NSCS移植研究提供体外研究基础。

1 材料和方法

1.1 动物

24 h之内的新生SD大鼠。

1.2 主要试剂和仪器

DMEM/F12、B27、bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）、EGF（表皮生长因子）均购自Gibco公司。抗体为:Nestin兔抗鼠多克隆抗体（博士德公司），GFAP单克隆抗体（Sigma公司），β-Ⅲ tubulin 单克隆抗体（Sigma公司），生物素标记山羊抗小鼠IgG（北京中杉生物试剂公司），山羊抗兔Cy3-IgG（博士德公司），DAB（北京中杉生物试剂公司），胎牛血清（FBS，杭州四季青生物试剂公司）。仪器：CO2培养箱（Thermo，美国），荧光倒置相差显微镜（Olympus IX70，日本）。病毒载体：Ad/EGFP，滴度为2×1011pfu/L。

1.3 方法

1.3.1 NSCS的分离、培养及鉴定

取新生大鼠置于0.5%碘伏中消毒，取脑，分离海马，剥离脑膜血管，将海马组织移入含有2%B27的高糖DMEM/F12培养液中，尽量将组织剪碎，轻轻吹打制成细胞悬液，400目筛网过滤，台盼蓝染色，细胞计数，以2×106个/L接种到6孔培养板内，最后加入EGF（终浓度20 μg/L）和bFGF（终浓度20 μg/L），置37℃、5%CO2平衡湿度培养箱中。

每2～3天半量换液1次，每7～10天传代1次。对第3代培养7天的细胞球参照文献［3］用Nestin免疫荧光染色法进行鉴定，荧光倒置相差显微镜观察拍照。

1.3.2 Ad/EGFP转染NSCS

把第3代培养7天的细胞按2×105个/孔接种到24孔板，每孔加入DMEM/F12+EGF+bFGF培养液1 ml，转染前1天半量换液。实验分为5组，感染复数（multiplicity of infection，MOI）分别为0∶1（对照组）、10∶1、20∶1、50∶1、100∶1，每组设8孔。根据感染复数计算加入所需腺病毒悬液的体积数，在EP管中将所需的腺病毒悬液与无血清的DMEM/F12培养液混合，将混合液按照分组分别加入到每组细胞中，每孔0.2 ml。

将24孔板置于37℃、5%CO2培养箱中培养，4 h后用DMEM/F12清洗细胞2次，弃病毒残液。每8 h观察EGFP的表达情况，常规半量换液。转染后48 h，在200倍荧光显微镜下，随机选取5个视野，分别计算绿色荧光阳性细胞百分数，用以代表Ad/EGFP对NSCS的转染效率。

1.3.3 Ad/EGFP体外转染对神经干细胞增殖的影响

各组分别在第7天、第14天、第21天细胞传代时各取100 μl，用台盼蓝染色并计算细胞活力，计算公式为：细胞活力（%） = （细胞总数-死亡细胞数）/细胞总数×100%。并在100倍显微镜下，各组选取培养板4角的4个区域及中央1个区域进行神经干细胞球的计数。参照文献［3］用Nestin荧光免疫细胞化学染色法对培养的细胞球进行鉴定。

1.3.4 Ad/EGFP体外转染对神经干细胞分化的影响

对照组和转染组的神经干细胞球在培养第7天时用10%FBS诱导分化，在第14天行免疫细胞化学反应，具体步骤参照文献［4］。每组任选3孔，每孔随机选择5个视野，相差显微镜下400倍视野计算细胞总数、β-Ⅲ tubulin和GFAP阳性细胞数，同时计算阳性细胞数占细胞总数的百分比；藉此区分神经元、星形胶质细胞，以鉴定转染Ad/EGFP的NSCS的多分化潜能。

1.4 统计学处理

计量资料以x±s表示，用单因素方差分析及两两比较检验；计数资料应用χ2检验。数据应用SPSS10.0进行统计学处理。检验水准:α=0.05 。