【求助】目标产物表达量低,普通PCR P不出来
丁香园论坛
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各位大侠,小妹要对HCE细胞的Toll样4受体做检测,但是细胞自身表达量太低,正常细胞提取RNA之后做逆转录都没有结果,而且我还要对其表达进行干扰,转染shRNA进去,结果就是做pcr时更没有结果了(内参很好),PCR反应条件如下:
20ul volum
cDNA loading 3ul
10xtaq buffer 2ul
dNTPs(2.5/each) 2ul
Mg2+ 1.5ul
primer(F+R) 0.2ul
Taq 0.2ul
ddH2O 11.1ul
94℃ 3min
94℃ 45s
56℃ 45s 38cycles
72℃ 1min
72℃ 10min,4℃ hold forever
PS:做逆转录时mRNA为2ug
PCR结果是用1.5%凝胶电泳检测,除了内参GAPDH,没有目的条带。都已经做了好多次,模板量由原来的1ul 增到3ul,还是没结果。之前做的该蛋白的overexpress表达体系有条带P出来,但是正常的对照都是没有的。现在要做干扰,要怎么做PCR才能检测到呢。
有哪位PCR高手给指点下啊,这么久没结果,老板要发飙了
20ul volum
cDNA loading 3ul
10xtaq buffer 2ul
dNTPs(2.5/each) 2ul
Mg2+ 1.5ul
primer(F+R) 0.2ul
Taq 0.2ul
ddH2O 11.1ul
94℃ 3min
94℃ 45s
56℃ 45s 38cycles
72℃ 1min
72℃ 10min,4℃ hold forever
PS:做逆转录时mRNA为2ug
PCR结果是用1.5%凝胶电泳检测,除了内参GAPDH,没有目的条带。都已经做了好多次,模板量由原来的1ul 增到3ul,还是没结果。之前做的该蛋白的overexpress表达体系有条带P出来,但是正常的对照都是没有的。现在要做干扰,要怎么做PCR才能检测到呢。
有哪位PCR高手给指点下啊,这么久没结果,老板要发飙了
一些PCR过程中的技术问题就不多做猜测了。
如果PCR引物没设计好,或者RNA没提好,或者PCR条件不对,自己解决去。因为你也没贴出来,站友们无法为你答疑。这里单从实验意义上进行分析:
印象中TLR4是机体对细菌的特异性识别受体,主要是LPS,脂多糖,鞭毛之类的应答。如果你没有做什么处理,那正常细胞的TLR4的表达量就应该很低的,建议用real time PCR来做,如果真的很低么,也没办法,就是P不出来了。
建议拿一个TLR4阳性样品做阳性对照,确认你的引物和体系没问题。
如果PCR引物没设计好,或者RNA没提好,或者PCR条件不对,自己解决去。因为你也没贴出来,站友们无法为你答疑。这里单从实验意义上进行分析:
印象中TLR4是机体对细菌的特异性识别受体,主要是LPS,脂多糖,鞭毛之类的应答。如果你没有做什么处理,那正常细胞的TLR4的表达量就应该很低的,建议用real time PCR来做,如果真的很低么,也没办法,就是P不出来了。
建议拿一个TLR4阳性样品做阳性对照,确认你的引物和体系没问题。
我的引物是没问题的,而且在过表达的细胞中提出RNA后再做PCR时工作的很好。RNA使用试剂盒提的,纯度也还可以。按照这个PCR条件以前做出过来一次,以后就再没做出来过。模板量及退火温度等相关因素能调的我都试过了,可是就是没结果。正常细胞中的TLR4表达量是不高,但是之前做出来过,现在重复不出来,而且以前做的瞬转质粒knock downTLR4表达细胞中,WB检测也出国结果。问题是现在这些都做不出来了。
如果用realtime PCR要怎么做呢,我之前没做过,能否指教一下?
如果用realtime PCR要怎么做呢,我之前没做过,能否指教一下?
拿一个TLR4的已知序列,比如以前P出来的PCR产物,10倍稀释梯度,去做标准曲线,以及做为阳性对照。
如果每个梯度之间的Ct值差正好是3.326, 扩增效率100%左右,那你的正常细胞的Ct值,是多少,就从这条曲线上去对。如果超过35了,说明真的很少,不用担心,不是你实验的问题。
但如果你的标准曲线都做不好,或者引物效率很差,那说明是你的体系出问题,或者是引物不行,或者是条件摸索的不好。
如果每个梯度之间的Ct值差正好是3.326, 扩增效率100%左右,那你的正常细胞的Ct值,是多少,就从这条曲线上去对。如果超过35了,说明真的很少,不用担心,不是你实验的问题。
但如果你的标准曲线都做不好,或者引物效率很差,那说明是你的体系出问题,或者是引物不行,或者是条件摸索的不好。
,谢谢bell
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