western难题

bixin1220： 这几天做western条带出现了奇怪的现象。

band变成空心了，还有actin条带像PCR一样拉长了，请各位能人帮忙，指点谜径。

这是actin，我这是用细胞，分细胞质里的蛋白和细胞核里的蛋白做了western blot。细胞质里的蛋白actin就变成这样了，细胞核里的actin就正常。是不是我分得不对了就出现这种情况？我用RIPA buffer 提取蛋白的。

这是核里的actin。算挺正常吧

丁香园网友 bixin1220 认为：

在这儿写出我做western的条件，有什么该优化的地方，希望大家帮我指出来。

1.上样 一般30μg蛋白，volume一般不超过3μl。

2.电泳 stacking gel 70V，分离胶100~120V。

3.转膜 100V 1h。

4.封闭　5% 脱脂牛奶 2h。

5.凡washing TBST 　7~10min/次，三次。

6.一抗　1：1000，4 ℃，overnight （一般15~17小时）。

7.二抗　1：1000~2000，室温 1h。

8.ECL 用pipet反复滴在膜上约3min。

9.曝光　在暗盒里10秒～3分钟不等，因样品而异。

什么问题会导致上面的那些条带呢？？？

毕业在即，心急如焚，望各位前辈高人不吝赐教。

丁香园网友 sunnyziyang 认为：

你那个空心的条带是蛋白过多曝光过强了，减少曝光时间就好了，这么强用胶片贴一下就好了，或者你少上点样啊，至于那个拖的现象，你确定你的抗体以前从来没出现过这种情况吗，会不会抗体的问题呢，还有就是会不会跑太久，分得太开了呢

丁香园网友 bingchuan001331 认为：

上样量太高了，边上孔的蛋白有溢出的现象。

还有空心的条带是压片时间久了，要么换个弱显试剂盒，要么缩短压片时间。

丁香园网友 bixin1220 认为：

非常感谢楼上两位，我电泳跑的时间是长了点，一共加起来可能有俩小时了，我以为条带分得越开就越好呢，这会是条带拖下来的原因吗？

再附上片子。这次我上样减量了，封闭时间长了点，4摄氏度里过夜十五个小时，空心现象减轻多了，fraction之后cytosol里的Actin也是好点了，就是条带托下来的现象还有，我再试一下减跑电泳时间。我压片只有7，8秒啊，这还长吗？我怕在短了压得太模糊了。

对了，我洒上ECL PLUS之后，有时候membrane上开灯的时候就隐约可见淡黄色的条带的痕迹，这种现象是否正常呢，不影响条带的质量？

罗罗嗦嗦写这么多，只不过是想给同道中人提供点参考，还有请大家多多指点。

丁香园网友 bixin1220 认为：

从上至下依次是cytosol，nuclear，actin条带。

nuclear拖下来的现象比cytosol的好多了，这是什么原因呢？

丁香园网友 sunnyziyang 认为：

洒上ECL PLUS之后，有时候membrane上开灯的时候就隐约可见淡黄色的条带的痕迹，这是正常现象，蛋白量多，条带很强的时候就会出现这种现象的，你应该很高兴，这样就代表你曝光的时间应该短一点，像你的七八秒其实也差不多了，试一下二三秒吧，应该也能曝出来