原位杂交的难题

问：

各位好！我现在在大鼠脑组织的mRNA的原位杂交，测BDNF，DAB显色的时候有淡黄色，但是复染之后就是满视野蓝核了，只有零星的阳性结果，并且据文献报道以神经元阳性细胞多见，但是我是胶质细胞的阳性多于神经元，几乎神经元都没有阳性细胞。我用的是地高辛标记的寡核苷酸探针，是天津灏洋的，我的试验流程如下：1.二甲苯两次，10分钟每次，100%、90%、80%酒精各一次，每次10分钟。2.打孔液室温10分钟 3.PBS冲洗3次每次三分钟 4.复合消化液室温20分钟 5.PBS冲洗3次每次三分钟，0.2ssc冲洗一次，2分钟 5.预杂交液37度1.5小时 6.PBS冲洗3次每次三分钟 7.杂交液37度4小时 8.2ssc37度冲洗三次每次5分钟，0.2ssc室温冲洗三次每次5分钟，PBS37度冲洗3次每次三分钟 9.加抗地高辛37度45分钟，PBS冲洗3次每次三分钟 10.3%过氧化氢室温10分钟，PBS冲洗3次每次三分钟 11.加过氧化物酶37度45分钟，PBS冲洗3次每次三分钟12.DAB显色

答：

1 切片脱蜡至水。（两次二甲苯各10分钟—100%已醇——95%已醇—70%已醇——50%已醇—30%已醇各5分钟——双蒸水，PBS洗两次，每次3分钟。

2． PBS室温10分钟.

3 .0.4%Triton X-100 PBS 15分钟.PBS洗两次

4.切片于37℃下孵育5min使其完全干燥，用新鲜配制的0.5% H₂O₂/甲醇室温处理30min以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3遍。

5. 每片滴加2~3滴1×Proteinase K，37℃孵育20~30min。

6.PBS洗3次×5min，蒸馏水洗1次。

7.4%多聚甲醛固定20分钟。蒸馏水洗3次

8.预杂交，37℃下孵育2h，不洗。

9.地高辛标记DNA探针在95℃下变性5min，然后立即冰浴，按探针制备比例按1：9和杂交液混合。

10..每张切片加1滴DNA探针/杂交工作液，加盖玻片（可用Parafilm膜代替）。＊不要留有气泡。

11.将切片放入湿盒中，42℃，4~8小时。（杂交过夜最好，但杂交时间最长不许超过24小时）。

12.揭掉盖玻片或Parafilm膜，30~37℃左右水温2×SSC洗涤5分钟×2次，

0.5×SSC洗涤15min×1次，0.2×SSC洗涤15min×2次。

13.滴加封闭液：37℃　30min，甩去多余液体，不洗。

14 滴加1滴兔抗地高辛-BSA，37℃ 60min，0.05mol PBS（5min×4次）。＊小心擦拭多余液体。

15.滴加1滴AP标记的羊抗兔IgG，37℃ 60min，0.05mol PBS（5min×4次）。＊小心擦拭多余液体。

16.DAB显色：使用DAB工作液1～2滴，加至标本上，一般显色20~30min。若无背景出现可继续显色，充分水洗。

17.苏木素复染，充分水洗。

18.酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。