做细胞冻存的人都经历过的这些致命败笔！你逃过了吗？

互联网2013-09-02

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在园子里经常看到询问冻存、复苏细胞的方法和注意事项。我新开此贴，专门介绍一些致命的“败笔”，和解决方法。希望对大家有帮助。

（以Raji为例）

一、细胞冻存：

1. 错误的时机：

细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解；连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）。

解决：最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。

2. 细胞太少：

冻存时细胞浓度低于1-5×1000,000/ml。（复苏很难成功）。

解决：离心后调整细胞浓度。（不要重新洗细胞）。

3. 盖子不紧：

冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。

解决：选择原配的管子和盖子（不同牌子/型号的颜色会有差别）。

4. 单薄的冻存盒：

放在－80度的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温。

解决：选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。（冻存的原则：缓降！）

5. -80度太久：

放在－80度冰箱的时间超过半年。（冰箱的温度难以恒定:开门/关门，电压不稳等）

解决：尽快转入液氮。

6. 液氮不足：

液面不能漫过所有细胞

解决：定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。

7. 取错细胞：

找不到/拿错冻存管。

解决：每支冻存管都标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册。

二、细胞复苏：

其实，只要冻存工作完成的好，复苏大多没有困难，但是要有耐心。（同样以Raji为例）

1. 取错细胞：

拿错冻存管。（快快快，匆忙之中，难免出错，况且－170多度，冻手！）

解决：

（1）核查记录册及冻存管上细胞的名称、时间是否一致。

（2）拿细胞时戴手套！

2. 水浴时间太长：

2min还没融化。（冻存管的壁较厚，隔热）

解决：

（1）适当提高水浴温度（37度－40度）。

（2）要是冬天，就选用保温盒。

3. 冰盒内时间太长：

复苏1h后，还没有加入新的培养液。（高浓度DMSO防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会，对细胞有毒性）

解决：提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间。

4. 失去耐心：

复苏三四天后，细胞没有任何动静，认为失败，倒掉所有细胞。（有些细胞复苏后一星期，才有起色）

解决：不要换液，耐心等待，两周后再做决定。

以上每一条都有惨痛教训！希望能对大家有帮助。经验之谈，欢迎大家交流探讨。