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做细胞冻存的人都经历过的这些致命败笔!你逃过了吗?

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在园子里经常看到询问冻存、复苏细胞的方法和注意事项。我新开此贴,专门介绍一些致命的“败笔”,和解决方法。希望对大家有帮助。

(以Raji为例)

一、细胞冻存:

1.  错误的时机:

细胞状态不好(长的太过了,培养液已经很黄;细胞可疑污染;细胞已 经开始凋亡或崩解;连续培养超过二个月,细胞性状已有改变改变)。

解决:最佳时机:细胞增殖旺盛,情况稳定,试验效果良好,复苏后两周内。

2.  细胞太少:


冻存时细胞浓度低于1-5×1000,000/ml。(复苏很难成功)。

解决:离心后调整细胞浓度。(不要重新洗细胞)。

3.  盖子不紧:


冻存管的盖子一定要拧紧,否则复苏水浴时会渗水,造成污染。

解决:选择原配的管子和盖子(不同牌子/型号的颜色会有差别)。

4.  单薄的冻存盒


放在-80度的冻存盒,壁太薄,细胞在被迅速降温。

解决:选择厚壁泡沫塑料盒,或塞入大量干棉花。(冻存的原则:缓降!)


                    5.  -80度太久:


放在-80度冰箱的时间超过半年。(冰箱的温度难以恒定:开门/关门,电压不稳等)

解决:尽快转入液氮。


6.  液氮不足:


液面不能漫过所有细胞

解决:定期测量液氮储备,保证细胞全部浸在液面下。


7.  取错细胞:


找不到/拿错冻存管。

解决:每支冻存管都标上细胞的名称,冻存时间,并记录在册。

                    二、细胞复苏:


                    其实,只要冻存工作完成的好,复苏大多没有困难,但是要有耐心。(同样以Raji为例)

1.  取错细胞:


拿错冻存管。(快快快,匆忙之中,难免出错,况且-170多度,冻手!)

解决:

(1)核查记录册及冻存管上细胞的名称、时间是否一致。


(2)拿细胞时戴手套!

                    2.  水浴时间太长:


2min还没融化。(冻存管的壁较厚,隔热)

解决:

(1)适当提高水浴温度(37度-40度)。


(2)要是冬天,就选用保温盒。

                    3.  冰盒内时间太长:


复苏1h后,还没有加入新的培养液。(高浓度DMSO防止胞内形成冰晶,冻存时保护细胞,但复苏融解后,浸泡时间太久会,对细胞有毒性)

解决:提前预定超净台,减少复苏后插在冰盒里等待的时间。

4.  失去耐心:


复苏三四天后,细胞没有任何动静,认为失败,倒掉所有细胞。(有些细胞复苏后一星期,才有起色)

解决:不要换液,耐心等待,两周后再做决定。

                    以上每一条都有惨痛教训!希望能对大家有帮助。经验之谈,欢迎大家交流探讨。


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