经验分享 | 如何优化细胞冻存与复苏实验？
丁香实验
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在丁香实验里经常看到询问冻存、复苏细胞的方法和注意事项。本篇分享常见问题和解决方法。希望对大家有帮助。
（以 Raji 为例）
一、细胞冻存
1. 错误的时机：细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已 经开始凋亡或崩解；连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）。
解决方法：最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。
2. 细胞太少：冻存时细胞浓度低于 1-5×1000,000/ml。（复苏很难成功）。
解决方法：离心后调整细胞浓度。（不要重新洗细胞）。
3. 盖子不紧：冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。
解决方法：选择原配的管子和盖子（不同牌子/型号的颜色会有差别）。
4. 单薄的冻存盒：放在 -80 ℃ 的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温。
解决方法：选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。（冻存的原则：缓降！）
5. -80 ℃ 太久：放在 -80℃ 冰箱的时间超过半年。（冰箱的温度难以恒定：开门/关门，电压不稳等）。
解决方法：尽快转入液氮。
6. 液氮不足：液面不能漫过所有细胞
解决方法：定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。
7. 取错细胞：找不到/拿错冻存管。
解决方法：每支冻存管都标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册。
二、细胞复苏
其实，只要冻存工作完成的好，复苏大多没有困难，但是要有耐心。（同样以 Raji 为例）
1. 取错细胞：拿错冻存管。（快快快，匆忙之中，难免出错，况且 -170 ℃，冻手！）
解决：
（1）核查记录册及冻存管上细胞的名称、时间是否一致。（2）拿细胞时戴手套！
2. 水浴时间太长：2min 还没融化。（冻存管的壁较厚，隔热）
解决：
（1）适当提高水浴温度（37 ℃－40 ℃ ）。（2）要是冬天，就选用保温盒。
3. 冰盒内时间太长：复苏 1h 后，还没有加入新的培养液。（高浓度 DMSO 防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会，对细胞有毒性）
解决：提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间。
4. 失去耐心：复苏三四天后，细胞没有任何动静，认为失败，倒掉所有细胞。（有些细胞复苏后一星期，才有起色）
解决：不要换液，耐心等待，两周后再做决定。
以上每一条都有惨痛教训！希望能对大家有帮助。经验之谈，欢迎大家交流探讨。
