碱性磷酸酶(AKP)米氏常数(km)的测定

原理：

当环境的温度、pH和酶浓度等条件一定时，酶促反应的初速度(V)随底物浓度[S]增高而加快，直到达到一个极限，即最大反应速度(V)。底物浓度与酶反应初速度的这种关系，米一曼(Michaelis—Menten)氏推导出如下公式，称为米—曼氏方程式：

式中Km称为米式常数。Km是反应速度等于最大反应速度一半（v=V/2）时底物的浓度。Km是酶的特征性常数。测定Km是研究酶动力学的一种主要方法。林一贝(Lineweaver—Burk)氏根据米—曼氏方程式又推导如下方程式：

以不同的底物浓度1/[S]为横坐标1/v为纵坐标，按直线回归方程计算，作图，并向纵轴方向延长，此线在横轴上截距为1/Km的负值。

本实验以碱性磷酸酶为例，选择不同浓度的磷酸苯二钠为其底物，磷酸苯二钠被AKP水解后，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4—氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低，其反应式如下

仪器 ：

中号试管 18支 恒温水浴

刻度移液管 8支 721分光光度计

比色杯

试剂 ：

1．底物液(10mmol/l，磷酸苯二钠)

称磷酸苯二钠(C 6 H 5 Na 2 PO 4 ·2H 2 O) 2．54克或磷酸苯二钠(无结晶水)2．18克，用煮沸冷却蒸馏水溶解并稀释至1000ml，加4ml氯仿防腐，棕色瓶4℃保存，一周内使用。

2．缓冲液(0．1mol/L磷酸盐缓冲液，pHl0．0)

无水碳酸钠6．36克及磷酸氢钠3．36克，溶于蒸馏水800ml，再加蒸馏水定量至1000ml。