米氏常数（Km）和最大反应速度（Vm）的测定

酸性磷酸酯酶动力学性质分析

米氏常数（Km）和最大反应速度（Vm）的测定

[原理]

在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。在底物浓度很低时，酶促反应的速度（v）随底物浓度的增加而迅速增加；随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢；当底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vmax）。

底物浓度与反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示：

式中

v——反应速度；

Km——米氏常数；

Vmax——酶反应最大速度；

[S] ——底物浓度。

从米氏方程式可见：米氏常数Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，米氏常数的单位就是浓度单位(mol/L或mmol/L)。

在酶学分析中，Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。Km与底物浓度、酶浓度无关，与pH、温度、离子强度等因素有关。对于每一个酶促反应，在一定条件下都有其特定的Km值，因此可用于鉴别酶。

测定Km、Vmax，一般用作图法求得。作图法有很多，最常用的是Linewaver-Burk作图法，该法是根据米氏方程的倒数形式，以1/v对1/[S]作图，可得到一条直线。直线在横轴上的截距为 -1/Km，纵截距为1/Vmax，可求出Km与Vmax。

[方法和步骤]

1、制作标准曲线

取9支 试管 ，按0～8编号。

1～8号管分别加入0.1至0.8mL酚标准应用液，并用蒸馏水将各管体积补充至1.0mL，0号管中加入1.0mL蒸馏水。各管各加1mol/L碳酸钠溶液2.0mL和Folin-酚稀溶液0.5mL，摇匀后，35℃保温显色10分钟。以0号管作空白，在可见光分光光度计680nm波长处读取各管的吸光度A 680 。

整个操作过程见下表：

管号	1	2	3	4	5	6	7	8	0
酚含量/μmol	0.04	0.08	0.12	0.16	0.20	0.24	0.28	0.32	-
0.4mmol/L酚标准应用液/mL	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5	0.6	0.7	0.8	-
蒸馏水/ mL	0.9	0.8	0.7	0.6	0.5	0.4	0.3	0.2	1.0
1mol/L碳酸钠溶液/ mL	2	2	2	2	2	2	2	2	2
Folin-酚稀溶液/mL	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5

以酚含量(μmol)为横座标，以A 680 为纵坐标，绘制标准曲线。

2、测定Km、Vmax

取 试管 7支，按照0～6编号，空白管为0号。各管按下表加入不同体积5mmol/L磷酸苯二钠溶液(pH5.6)，并分别补充0.2mol/L pH5.6乙酸盐缓冲液至0.5mL。35℃预热2min后，逐管记时加入酸性磷酸酯酶酶液0.5mL，摇匀，精确反应15min。各管反应时间到达后立即加入1mol/L碳酸钠溶液2mL，摇匀，再加入Folin-酚稀溶掖0.5 mL，35℃保温显色l 0min。0号管内最后加入0.5 mL酶液，其它操作与上述各管相同。冷却后以0号管作空白，在可见光型 分光光度计 680nm波长处读取各管的吸光度A 680 。

在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。在底物浓度很低时，酶促反应的速度（v）随底物浓度的增加而迅速增加；随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢；当底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vmax）。