豚鼠最大剂量法

器材：

小研钵 3 个、30 ml 广口瓶 3 只、2 ml 注射器若干只、5 号针头至少 10 只、条状 1 cm x 1000 cm 医用胶带、标签纸、块状 26 cm x 500 cm 医用胶带、保鲜膜、吸水滤纸、纱布。

试剂：

① 硫化钡

② 市售完全弗氏佐剂（FCA）（取乳化好的灭菌完全弗氏佐剂与无菌生理盐水按 1：1 的比例进行完全乳化后，即制得完全弗氏佐剂应用液）

③ 淀粉

④ 滑石粉

⑤ 1% 2,4-二硝基氟苯（DNFB）丙酮溶液或 1% 的 2,4-二硝基氯苯（DNCB）丙酮溶液

⑥ 医用生理盐水

⑦ 十二烷基磺酸钠

豚鼠最大剂量法的基本过程可分为如下几步：

（一）预试验：预试验是为了确定主试验中所用试验样品的浓度。用通用溶剂制备的未稀释的浸提液不需要进行预试验。

为了对主试验期间可能发生的皮肤激发状况进行评价并对读数进行解释，应考虑对全部预实验动物，一般至少 3 只，进行试验样品和弗氏完全佐剂（FCA）等体积乳化后注射的预处置。再将试验样品的系列稀释物局部应用于动物腹侧部位。24 小时后除去封闭性包扎带和敷贴片，按表 10-5-24 给出的 Magnusson 和 Kligman 分级标准评价贴敷部位的红斑与水肿反应程度。

进行试验样品浓度选择时，应注意选择的最高浓度在主试验的局部诱导阶段可导致动物皮肤产生轻度红斑，但不对动物产生其他有害作用，并且在激发阶段不致使动物因皮肤刺激反应产生红斑。这样的选择使得既可在诱导阶段使浸提物易于进入动物皮肤，又不致在激发阶段因皮肤刺激反应产生的红斑而干扰试验结果的观察。

（二）主试验

A 试验前，称量并记录每只豚鼠体重。在制备浸提液的同时，20 ml 完全弗氏佐剂、30 ml 生理盐水（阴性对照）同时经 121 ℃ 1 小时灭菌。

B 配制试样。完全弗氏佐剂应用液：用注射器分别吸取等体积的完全弗氏佐剂和生理盐水，放入小研钵中充分研磨成均匀的乳化液后，转移到注射器中备用。

C 浸提液 ＋ 完全弗氏佐剂应用液：用注射器分别吸取 4 ml 浸提液和 4 ml 弗氏佐剂应用液，放入小研钵中充分研磨成均匀的乳化液后，转移到注射器中备用。生理盐水＋完全弗氏佐剂应用液：用注射器分别吸取 4 ml 生理盐水和等量的 4 ml 完全弗氏佐剂应用液，放入小研钵中充分研磨成均匀的乳化液后，转移到注射器中备用。

D 1% DNFB ＋ 完全弗氏佐剂应用液：用注射器分别吸取 3 ml 2,4-二硝基氟苯（DNFB）和 3 ml 完全弗氏佐剂应用液，放入小研钵中充分研磨成均匀的乳化液后，转移到注射器中备用。

（三）皮内诱导

A 试验前将每只动物颈肩胛处的被毛剪去 30 mm x 40 mm。

B 在每只动物的除毛处进行 75% 乙醇常规皮肤消毒，然后作三对 6 点皮内注射试样（图 10-5-26），每个点注射 0.1 ml 试样。各组试样分别为：

试验材料组

第 1 对完全弗氏佐剂应用液

第 2 对浸提液

第 3 对浸提液＋完全弗氏佐剂应用液

阴性对照组

第 1 对完全弗氏佐剂应用液

第 2 对生理盐水

第 3 对生理盐水 ＋ 完全弗氏佐剂应用液

阳性对照组

第 1 对完全弗氏佐剂应用液

第 2 对 1% DNFB 丙酮溶液

第 3 对 1% DNFB 丙酮溶液＋完全弗氏佐剂应用液

C 观察记录注射后动物的异常反应。

若浸提介质为极性介质，如橄榄油，则将以上步骤中所用生理盐水替换为橄榄油即可。

（四）局部诱导阶段

A 皮内诱导阶段后 7 天（± 1 天），制备新鲜浸提液，试验前应对每只动物局部诱导部位的皮肤再次剪毛。

B 按注射的试验样品中选定的浓度或试验样品浸提液，采用封闭式斑贴法，滴加试样于约 8 层 2.5 cm x 2.5 cm 擦镜纸上作为敷贴片，待浸透擦镜纸后使之覆盖诱导注射点（图 10-5-27），依次覆盖 3 cm x 3 cm 大小的塑料薄膜和纱布，再粘贴块状和条状医用胶布，使敷贴片固定不脱落。各组试样分别为，试验组：浸提液；阴性对照组：生理盐水；阳性对照组：1% DNFB 丙酮溶液。如按最大浓度未产生刺激反应，应在局部敷贴应用前（24 ± 2）小时，试验区用 10% 十二烷基硫酸钠进行预处理，按摩导入皮肤，以便产生轻微的炎性刺激，便于样品或样品浸提液被皮肤吸收。

C 观察记录敷贴后动物的异常反应，并于（48 ± 2）小时后除去敷贴片和包扎物。

（五）激发

A 局部诱导（14 ± 1）天后对动物进行激发。激发试验的前一天，对每只动物进行脱毛。配制脱毛剂涂在动物的侧腹背部白毛处，待动物皮毛颜色变成黄绿色后，用温水冲净残留脱毛剂，擦干动物身体。采用封闭式斑贴法，脱毛后 24 小时在脱毛区皮肤处试验，方法和试样同局部诱导。做阳性对照组的激发试验时，DNFB 丙酮溶液的浓度应降低，使阳性结果能够出现且对实验动物的损害不致太过厉害，如浓度可调至 0.5% 或 0.1% 甚至 0.05%。观察记录激发后动物的异常反应，并于 24 小时后除去敷贴物。除去敷贴片后 24 小时和 48 小时，观察试验组和对照组动物激发部位皮肤情况（图 10-5-28，图 10-5-29），按表 10-5-24 规定的分类计分系统描述每一激发部位和每一观察时间的皮肤反应情况（表 10-5-25)。