一氧化氮合酶组织化学染色法
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一氧化氮合酶组织化学染色法
一氧化氮合酶(nitrfic oxides synthase,NGS)是一种连接酶,能催化前体物质L精氨酸生成L瓜氨酸和一氧化氮(NO)。NO是中枢和外周神经系统中的一种神经递质,活细胞间信使和内皮源性松弛血管的介质,在神经、心血管及免疫系统中有广泛的作用。
NO极不稳定。易于扩散游离,半衰期短,不易检测。因NOS是合成NO的关键酶,故通常通过检测NOS的活性来评估NO的分布和功能。
NOS有3种异构型,即神经型NOS(neuronal NOS,nNOS)、内皮型NOS(endothelial NOS。eNOS)和细胞因子诱导型NOS(inducible NOS,iNOS)。由于还原型辅酶Ⅱ―黄递酶(NADPH-d)与NOS在化学结构和组织定位上有极高的一致性,且也与NO生成密切相关.故人们常采用NADPH-黄递酶法来显示NOS活性。
1.原理 在βNADPH存在下,NOS的C末端能将NADPH电子转移到NBT,将NBT还原成不溶性蓝紫色甲腊沉淀产物。
2.孵育液配制
β―NADPH 10mg
NBT 5mg
Triton X―100 0.03ml
0.05mol/L TB(pH 8.0) 9.97ml
临用前配制。
3.染色程序
(1)固定:4%多聚甲醛(0.1mol/LPBS配制)灌流固定,取材后入同样固定液再固定1小时(4℃),20%蔗糖中4℃过夜;
(2)冰冻切片:厚10―401.Lm;
(3)孵育:切片人孵育液中37%孵育30分钟~1小时;
(4)终止反应:切片人0.05mol/LTB或蒸馏水中;分钟;
(5)常规脱水、透明、封片或直接用甘油明胶封片。
4.结果与评价 反应产物为蓝色或蓝紫色沉淀。NADPH-黄递酶法显示NOS活性,方法简便经济,应用广泛,但不能区分NOS亚型。
5.对照实验 在孵育液中除去β―NADPH或用0.1mol/L N―亚硝基精氨酸(NOS抑制剂)预孵育切片1小时,结果应为阴性。