细胞支原体污染一般情况及预防措施

细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时，会严重的影响实验的结果。而细菌、真菌等之微生物污染时，较易自培养基等的外观变化察觉。但是若受到支原体之污染时，细胞之外观较无明显变化，但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。

各国细胞库支原体污染的统计表，如下：

国家　 受支原体污染(%) 报告年度

USA－FDA 15 1993(past 30 years)
USA－ATCC 15-20 1992
Japan－(IFO，RIKEN，JCR 80~30~22 1981 1987-19931998
Germany－DSM 36 1990-1994
Argentina 65 1987
Israel 32 1986-1993
China 95 1990

造成支原体高污染率的原因为：

1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）

2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化

3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式

4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染

5、研究或操作人员忽略污染问题

支原体污染了来源：

1、已受污染的细胞

2、操作人员的疏失

3、已受污染的培养基、血清

4、操作环境不良、实验器具不洁等

由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。

去除支原体污染：

1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）

2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine

3、Anti-sera

预防与控制方面可从以下各点加强注意：

设备方面：

1、使用已作支原体测试ok之细胞株

2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞

3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞

检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。

实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求

有关支原体污染之问题与回答：

1、应如何避免细胞污染？

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。 主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。 严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。

2、如果细胞发生微生物污染时， 应如何处理？

直接灭菌后丢弃之。

3、支原体 (mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？

不能。 除极有经验之专家外， 大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。

4、支原体污染会对细胞培养有何影响？

支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。

5、侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？

直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。

支原体之检测：

直接培养法

 原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。

特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。

缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。

材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。）

培养基制备：

基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。

· 10x stock solution (1 liter) ：称取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于 -70℃。

· 液体培养基 (1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。

· 固体培养基 (1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。

步骤：

· 取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液， 接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。

· 另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。

· 另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。

结果判读：

· 支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agar plate上。需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。

· 典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。

· 若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agar plate，若是细胞则不会生长。