慢病毒载体介导红色荧光蛋白基因转染人脑胶质瘤干细胞
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1.1 实验材料和仪器
人脑胶质瘤干细胞、红色荧光蛋白基因的慢病毒(RFP-Lentivirus);CD133,Nestin 兔抗人,FITC、Cy3 免疫荧光试剂盒;DMEM/F-12,N2 添加剂,BFGF,EGF 因子;荧光显微镜,倒置显微镜;CO2 培养箱。(1)脑胶质瘤干细胞的培养与传代,鉴定
将人脑胶质瘤干细胞SU2 反复吹打成单细胞悬液,接种于无血清干细胞培养基(含DMEM/F12,EGF 20ng/ml,bFGF 20ng/ml,1/100N2)培养瓶中,置于37℃,5%CO2 培养箱。每天观察细胞生长状态,于显微镜下观察、摄片,并连续培养传代。然后取生长良好的未转染RFP 的悬浮球体行CD133、Nestin 免疫荧光染色。(2)慢病毒转染胶质瘤干细胞
将球状干细胞用0.02% 胰酶消化后反复吹打成单细胞悬液,稀释胶质瘤干细胞计数1000~100000 个转移至24 孔板,每孔设2~3 个复孔。每孔加400μl 培养基,待细胞生长良好、细胞密度达30%~40%,每孔加1~2μl 带红色荧光病毒颗粒,轻轻混匀,病毒量不宜过高。8h 左右离心后弃培养基,换上新鲜培养基。2~3d 后在荧光显微镜下观察红色荧光表达情况。(4)生长曲线绘制
将球状SU2 和RFP-SU2 经0.02 %胰酶消化并离心后加人DMEM/F12 培养液制成单细胞悬液并行细胞计数。将两组细胞分别分成9孔,每孔设置3 个副孔,细胞以5×103 /孔接种于96 孔板,置于37℃、5% CO2 条件下培养。
分别于培养的24h、2d、3d、4d、5d、6d、7d 进行检测,每孔加入5mg/ml MTT 溶液20μl,37℃、5%CO2 的条件下孵育4h 后终止培养。小心吸净上清液,加入二甲基亚砜(DMSO)100μl,平板床振荡10min。
在酶联免疫检测仪上测定细胞的吸光度(OD)值,所用实验波长为490nm。将RFPSU2组与未进行RFP 转染的单纯SU2 生长对照组于转染后每日按上述步骤进行MTT 检测。以时间为横轴,OD 值为纵轴, 绘制两组细胞的生长曲线。
(5)慢病毒转染后脑胶质瘤干细胞的免疫荧光染色
取经多次体外连续传代培养慢病毒转染后的脑胶质瘤干细胞(RFP-SU2)行CD133、Nestin 免疫荧光染色。
具体步骤:将RFP-SU2 种植到经多聚赖氨酸处理的玻片上,56℃温箱中烘干,PBS 洗3 次,4% 多聚甲醛室温固定20min,PBS 洗2 次,0.1% Triton-X100 孵育10min,PBS 洗2 次;1%BSA封闭,室温孵育1h,PBS 洗2 次;分别加入适量以封闭液稀释的第一抗体CD133、Nestin,4℃孵育过夜;PBS 洗3 次,加入FITC(两种抗体只能加FITC,因为转染后的干细胞表达红色荧光蛋白)耦联的二抗,室温避光孵育2h ;PBS 洗3 次,以50%、70%、95% 和100% 四个浓度梯度的乙醇梯度脱水,甘油封片,取出盖玻片,覆盖在载玻片上,自然晾干,于荧光显微镜下观察,摄片。