慢病毒载体转染造血细胞

慢病毒载体转染造血细胞

材料

试剂

抗 CD； M 抗体结合的磁珠（若转导早期造血干细胞； Miltenyi Biotec In c .)

牛血清白蛋白（BSA; P B S 中 2% )

于 100 ml PBS 中溶解 2 g BSA (片段 V)。通 过 0. 2um 滤器过滤。 4°C 保存。

CaCl2 (2mol/L)

溶解 29.4 gCaCl2 (J.T.Baker) 于 70 ml 水中。补水至 100 ml。 0.2nm 滤器过滤。

细胞

293T (含 S V 4 0 大 T 抗原的人类胚肾细胞）

H T 1080 (人 成 纤 维 肉 瘤 细 胞 系）

被转导的细胞（靶细胞）

甲 醛（3. 7% 在 P B S 中）

用 PBS 以 I : 1 0 比例稀释 3 7 % 甲醛 溶 液（Sigma-Aldrich)。

2 X HEPES 缓 冲 液（ H BS; 0.05m ol/L HEPES、 0.28m ol/L NaCl, 以 及I .5 mm ol/L Na2 HPO4 , pH 7. 12)

于 200 ml 水中溶解 2. 38 g HEPES、 3. 28 g NaCl、 42. 6 mg Na2 HPO4。 0. 2umn 滤器过滤。

293T 和 H T 1 0 8 0 细 胞 培 养 基

含 10% 胎 牛 血 清（FBS) 的 高 糖（4500 mg/L) DMEM 培养基， 100ug/ml 青霉素， 100ug/ml链 霉 素

靶细胞培养基

根据细胞类型和实验设计选择合适的培养基，细胞因子和其他营养成分。如在此法中，所用 的 CD34+转导培养基为： IMDM, 含 2 0 % BIT9500 (干细胞技术， Vancouver, B.C.Canada)、 100ng/ml 干 细 胞 因 子（SCF)、 100ng/mlFlt3-lig，以及 100ng/ml 促血小板生成素（TPO)。

磷酸盐缓冲液（P B S ， p H 7. 4)

137 mm ol/L NaCl

2.7 mm ol/L KCl

8.lm m ol/L Na2 H P 0 4

I . 5 mmol/L KH2P 〇 4

质粒 DNA

此 法 的 质 粒 D N A , 即 含 目 的 转 基 因 的 pHIV-GFP、 pCgp、 pCMV-reu、 pCMV-G。依据操作 说 明 用 QIAGEN质粒试剂盒纯化所有的质粒DNA。

聚 凝 胺（4 mg/ml)

溶解 40 mg 聚 凝 胺（hexadimethrine bromide) 于 IOml水 中 。 0 .2um 滤器过滤。 4°C 保存。RetroNectin (Takara Mirus Bio Inc. > Madison, Wisconsin)

依据操作说明制备 25fig/ml RetroNectin。 4°C 保 存 。

TE 79/10

用水以 I : 10 比例稀释 TE79 (lOmmol/L Tris-HCl 和 lm m ol/L EDTA, pH 7. 9 ) 。 0.2um滤器过滤。

仪器

离 心 管（1X3. 5in polyallomer [Beckman])

用 前 高 压 灭 菌（15psi, 15〜20 min)。

荧光激活细胞分离器（FACS)

孵 箱37℃

非组织培养处理平板（4 8 孔 和 2 4 孔）

培 养 板（12 孔）

注 射 器（30 ml)

针头式过滤器（0. 2um)

细胞培养 M (IOmm)

超速离心机和 SW 28 转 头（Beckman)

方 法

慢病毒载体的生成：载体的包装
I. 293T 细胞在完全培养基， 37°C 烘箱， 5 % C O 2 中生长。转染 前 24 h ，将指数生长的293T 细胞以 4 X 10⁶ 个/平板的密度接种于 Io o m m 培养皿中。转染时细胞密度约为 80% 。

2•每 IOOm m 平板细胞制备 I m l 磷酸轉-D N A 悬液，方法如下：

a•为每个转染平板准备两个无菌管，标记为管〗和管 2。

b•向管 1 中加人 0. 5m l 2 X H B S 。

c. 向管 2 中加入 TE 79/10。 TE 79/10 的体积等于 440W 减 去 DNA 溶液的体积。

d•向管 2 中加人 15/xg 含转基因的转移载体， 15ugpCgp、 5ugpCMV-rew 以及 5ug pCMV-G ，混勻。

e•向管 2 中加 60ul 2mol/LCaCl2，混勻。

f•将管 2 中的液体逐滴地加入管 1 中并轻微混勻。

g . 室温孵育 30 min。

3•吸打或漩涡混合沉淀。

4 . 向含有细胞的 IOOm m 平板中加 I m l 悬液。缓慢滴加并轻柔晃动培养基。将平板放回3 7 °C 孵箱孵育 4 h 并弃去沉淀。

S•用 6m l 新鲜培养基替换旧培养基。加 60ul 0.6m o l / L 丁酸钠。孵箱孵育。

6.48 h 后，收集上清，一 80°C 冻存，或进行浓缩步骤。

载体的浓缩

7.900 g 离 心 I O m in 上 清（新鲜收集或从冰箱中解冻）以去除细胞碎片。

8.0.2 um 针头滤器过滤上清。

9 . 将上清转移到高压灭菌的离心管中 4°C， BeCkm anS W 28 转头， 24 500r/m in 下超速离心 I. 5 h 以浓缩上清液。

10• 弃去上清，将沉淀以适量的培养基重悬，例如，若 需 要 1 〇〇倍浓缩，则 对 应 30 ml原始溶液需加 300ul 培养基。

1 1 . 以 10〜1 5 4 分装浓缩后的载体，一 80°C保存。

载体的滴度测定

12•以 5X10⁴ 个/孔接种于 12 孔板，完全培养基， 37°C 孵箱， 5% C02 培养过夜。

13•向细胞中加人各个稀释梯度的载体以及 4ul/m l 聚凝胺。继续培养 48 h 。

14•消化细胞。离心，弃上清，用 300ul 含 3. 7 % 甲醛的 PB S 重悬细胞。

15.FA CS 分 析 E G F P 阳性细胞的百分率。

滴度以每毫升浓缩载体的转染单位（TU) 表 示 ，即 TU/ml。

慢病毒载体转染靶细胞

用于转染培养的造血细胞

16•在 2 4 孔板中用 Im l 培养基以 2XIO⁵个细胞/孔接种指数生长的细胞。

17•根据细胞类型的不同加人不同体积的浓缩载体。对于 K 562 细 胞 系（C M L 白血病细胞系）来说，感 染 指 数（m oi ) 为 10 时可以达到 100% 的转导率。

1 8 . 加 知 g /m l 聚凝胺。细胞于 37°C 孵育。

19•孵育过夜后，将细胞离心，弃上清并用新鲜培养基重悬，再培养。

2 0 . 转 染 48 h 后 ，由 FA CS 分析计算转染效率 （见疑难解答)。

转染早斯造血干细胞

21•依操作流程，利 用 结 合 抗 CD34+抗体的免疫磁珠从脐带血或骨髓中分离纯化CD34+造血干细胞。

22.转染前 48 h ，在 C D 34+转染培养基中培养 C D 34+细胞。

2 3 . 用 0.2m l 25pg/ml RetroNectin (约 5/ug/cm2) 包被 48 孔培养板，室温下 2 h。

2 4 . 弃 去 R etro N ectin , 然后添加 0• 2m l 含 2% B SA 的 PB S 封闭。室温下 30 min。

25•用 PB S 清洗培养板后，用普通的 IM D M 培养基调整慢病毒载体至合适的感染指数(范 围 5〜4 0 )，终体积 200^1，加入已包被的平板中。

26.37°C 孵 育 2 h 后 ，弃去载体上清，用 PB S 清洗培养板。

2 7 . 以 I X l O 5 个/孔的密度， 〇.2m l 生长培养基将预刺激的 CD34+细胞加人孔中， 37°C孵育。

28•过夜培养后，将细胞离心，以 Im l 培养基重悬，并转移细胞至 2 4 孔板，孵箱孵育。

2 9 . 转 染 6 d 后， FA CS 分析转染效率。