斐林试剂比色法

斐林 试剂 比色法

[目的与要求]

1、掌握还原糖定量测定的原理和方法

2、学会分光光度计的使用

3、熟悉标准曲线的制作方法

[原理]

斐林 试剂 比色法是利用斐林试剂的甲、乙液混合后，甲液的硫酸铜与乙液的氢氧化钠作用生成天蓝色的氢氧化铜沉淀，该沉淀在碱性溶液中与乙液的酒石酸钾钠反应生成复杂的化合物（酒石酸钾钠铜）。

后者具有与普通铜盐略有不同的天蓝色，但仍有铜盐所有的普通反应。天蓝色的酒石酸钾钠铜在590nm波长处有最大吸收峰。

单糖和多糖的水解物都含有具还原性的醛基或是酮基，在碱性条件下煮沸能使斐林试剂中的二价铜离子还原为一价的氧化亚铜，而使蓝色的斐林试剂脱色，脱色的程度与溶液中含糖量成正比。

椐此，在590nm波长处测定不同情况下溶液的光吸收值，并制作标准曲线，可求出样品中糖的含量。

此法的优点是操作简便，斐林试剂可不作定量配制，测定误差在 ±0.02%，但须经常作标准曲线校正。缺点是试剂不稳定，需临时配制，且容易受肌肝（酸）等的干扰，这在医疗分析上很不利。其测定范围在0.1～0.5mg/mL还原糖，如果含糖量超过此范围，误差显著增大。

[方法和步骤]

1、标准曲线制作

按下表在各 试管 中分别加入1mg/mL葡萄糖标准溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3mL，并分别加蒸馏水补足到3mL，每管含葡萄糖各为0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mg，分别在各管中加入2mL斐林试剂，混合后，在 试管 口用玻璃球盖好，放入沸 水浴 加热15min，取出后在流水中冷却，再经1500r/min离心15min，取上清液在590nm波长处进行比色测定，以蒸馏水作比色时的参比，读取含不同浓度糖的各管的光密度值和空白管的光密度值。然后把空白管的光密度值减去各管不同浓度糖的光密度值，并以此值作纵坐标，各相对的糖含量作横坐标，绘制标准曲线。

试剂管号	0	1	2	3	4	5	6	还原糖	总糖
1mg/mL葡萄糖/ mL	0	0.5	1.0	1.5	2.0	2.5	3.0	1.5	1.5
斐林试剂/ mL	2	2	2	2	2	2	2	2	2
水/ mL	3	2.5	2	1.5	1	0.5	0	1.5	1.5
总体积/ mL	5	5	5	5	5	5	5	5	5
A 590

2、样品的测定

（1）还原糖提取液的制备

称取2g马铃薯淀粉于150mL三角烧瓶中用少量水湿润均匀，再加入约70mL水搅拌，50℃ 水浴 保温15min，取出后定容至100mL即得20g/L马铃薯淀粉提取液。待自然沉淀或砂芯漏斗过滤后，取上清液1.5 mL进行还原糖的测定。

总糖水解液的制备

称取1g马铃薯粉，置于150mL三角烧瓶中先用少量水湿润均匀，加入6mol/L HCl 10mL，再加 蒸馏 水15mL。于沸水浴中加热水解30min，冷却后，用6mol/L NaOH调pH至中性，再定容至100mL，然后吸取10mL（如有不溶物应取上清液）稀释至100mL，即得马铃薯粉总糖水解液。取水解液1.5mL如上表所示。