斐林试剂比色法测定还原糖

一、原理

植物组织中的可溶性糖可分为还原糖（主要是葡萄糖和果糖）和非还原糖（主要是蔗糖）两类。还原糖具有醛基和酮基，在碱性溶液中煮沸，能把斐林试剂中的Cu2+还原成Cu+，使蓝色的斐林试剂脱色，脱色的程度与溶液中含糖量成正比。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：新鲜植物样品或烘干粉碎过的植物样品。

（二）仪器设备：

1. 分光光度计；

2. 分析天平（感量1／10000）；

3. 水浴锅；

4. 具塞刻度试管；

5. 刻度吸管；

6.容量瓶；

7. 研钵；

8. 离心机。

（三）试剂：

1. 斐林试剂A液：40gCuSO4.5H2O溶解于蒸馏水定容至1L。

2. 斐林试剂B液：200g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6.5H2O）与150g NaOH溶于蒸馏水中，并定容至1升。A、B两液分别贮存，使用前等体积混合。

3. 0.1％葡萄糖标准液：取80℃下烘至恒重的葡萄糖0.1000g，加蒸馏水溶解，定容至100ml。

4. 0.1NNaOH。

5. 甲基红指示剂：0.1g甲基红溶于250ml 60％乙醇中。

6. 10％Pb（Ac）2。

7.饱和Na2SO4。

三、实验步骤

1. 标准曲线的制：各管混合后加塞，于沸水浴中加热15min。取出后自来水冷却，1500rpm离心15min。取上清液，用分光光度计在590nm波长下比色，以蒸馏水作对照，读取吸光度用空白管的吸光度与不同浓度糖的各管的吸光度之差为横坐标，对应的糖含量为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 样品中还原糖的提取：取新鲜的植物样品洗净、擦干、剪碎，称取10.00g，放入研钵中研磨至糊状，用水洗入250ml容量瓶中。当体积近150ml左右时，加2～3滴甲基红指示剂，如呈红色，可用0.1mol/L 的NaOH中和至微黄色。若用风干样品，可称取干粉3.00g，先在烧杯中用少量水湿润，然后用水洗入250ml容量瓶中，如显酸性，可用上法中和。将容量瓶置于80℃的恒温水浴中保温30min，其间摇动数次，以便将还原糖充分提取出来。对含蛋白质较多的样品，此间可加10％Pb(Ac)2，除去蛋白质，至不再产生白色絮状沉淀时，加饱和Na2SO4除去多余的铅离子。30min后取出冷却，定容至刻度，摇匀后过滤待测。

3. 样品测定：吸取6ml待测液，加4ml斐林试剂，其它操作与标准曲线相同，在590nm波长下读取吸光度。以不含样品的空白管的吸光度减去样品管的吸光度，在标准曲线上查出糖含量.

四、结果计算

按下式计算还原糖的百分含量： 还原糖（％）＝查得的糖毫克数×样品总体积×稀释倍数/(测定时取用体积×样品重×1000)×100