小鼠脾脏树突细胞的分离－胶原酶消化制备脾脏细胞悬液

辅助方案：

胶原酶消化制备脾脏细胞悬液

实验材料：

1. 4000U/ml胶原酶D，融化后置于冰上

2. HBSS，已灭菌，含Ca+ 、Mg2+ （购置于Life Technologies）

3. 小鼠脾脏

4. 皮下注射针，22G×11/2 in内径（Becton Dickinson）

5. 10ml、5ml一次性注射器（如Becton Dickinson）

6. 100mm直径培养皿（如Falcon）

7. 2个高压灭菌锅的锯齿状解剖镊（如Roboz）

8. 高压灭菌的不锈钢网：将40目的不锈钢网剪成5cm×5cm的小方格，向下折叠边缘，然后将四边弯成浅的矩形碗；锡箔纸包裹后高压灭菌。

实验方法：

1. 将2管1ml的4000U/ml胶原酶D稀释（足够用于20个脾脏）：1ml加入9ml HBSS（稀释至4000U/ml，步骤8使用），1ml加入39ml的HBSS（稀释至100 U/ml）。置于冰上。

2. 将22G针头连接在10ml的注射器上，充满100 U/ml的胶原酶。将10ml的100 U/ml溶液加入100mm的培养皿中。

3. 取另外一个直径100mm的培养皿进行操作。一只手拿镊子，另一只手拿注射器，拇指放在活塞上。用镊子夹住小鼠脾脏，用针头刺入脾脏被膜的狭窄边缘，注入100 U/ml胶原酶100ml。用镊子将脾脏推向针头，使针头前进几毫米。重复注射胶原酶，继续直到1ml胶原酶都注射入脾脏，针头从另一端刺穿脾脏。

4. 用针头撕开脾脏，将其转移至含胶原酶的培养皿中（步骤2）。重复操作，直到所有脾脏都注射和撕开。

5. 从第二个培养皿中收集细胞悬液加入到置于冰上的50ml离心管中。用3ml 100 U/ml的胶原酶漂洗培养皿后加到上述50ml离心管中。

6. 加入3ml 100 U/ml胶原酶至培养皿中。将撕碎的脾脏依次转移至培养皿。用2个镊子将它们撕成边长1mm的小碎块，使其能通过5ml吸管的内径。当所有的脾脏都撕碎后，将先前放置脾脏碎块的培养皿中的胶原酶溶液加入进来，用5ml吸管猛烈吹打多次。

7. 倾斜培养皿，将大块碎片除开，将细胞悬液转移至第5步的置于冰上的50ml离心管中。用几毫升100 U/ml的胶原酶洗涤培养皿后加入至离心管中。

8. 在培养皿留下的脾脏碎块中加入10ml 400 U/ml的胶原酶。吹打数次后于培养箱里放置30-90min。

9. 在孵育的最后阶段，猛烈吹打碎片，将其吸至直径100mm培养皿的无菌钢网上。

10. 用镊子固定钢网一端，用几毫升100 U/ml胶原酶洗涤碎块，然后用无菌的5ml注射器活塞碾磨碎块。捣烂直到所有的红色物质从组织中去除。再用几毫升100 U/ml胶原酶洗涤钢网。

11. 将钢网从培养皿中拿开，丢弃无色的黏附的被膜碎块。猛烈地吹打培养皿中的液体，将其转移至步骤7的50ml离心管里。用几毫升100 U/ml胶原酶洗涤培养皿后一同加入到离心管中（约有0.5%为树突细胞或者更少）。

12. 如果需要，即可用高密度的BSA离心。

附录：

抗体偶联的绵羊红细胞（EA）：

以PBS洗涤2.5ml收集的绵羊红细胞（Alsever液中提取；Cocalico）3次，每次洗涤后均以350g离心5min。然后用新鲜PBS稀释为5%细胞悬浮液（109 个细胞/ml）。将高致敏的兔抗红细胞血清于5%细胞悬液以1：50稀释（可能形成亚凝集剂量的抗体）。

室温下孵育2h，偶尔温和地颠倒溶液。用RPMI1640（Life Technologies）洗涤形成的EA3次，随后以PBS将EA稀释为5%细胞悬液。于4℃保存2周，使用前再以RPMI洗涤一次。

RPMI-5完全培养基：

RPMI1640培养基（Life Technologies），含有:

5%FBS，56℃热灭活1h

10mmol/L HEPES

20mg/ml硫酸庆大霉素（Life Technologies）

50mmol/ml 2-ME

过滤除菌

高密度BSA溶液：

在1L容量瓶中，加入186ml PBS，29ml 1mol/L NaOH，65ml水（小心操作，注意液体不要再瓶内飞溅）。不要搅拌，将106g BSA（Cohn fraction V，推荐采用完全BSA）铺在溶液表面，盖上锡纸，冷藏过夜，使BSA慢慢溶解。

第二天，温和摇晃已变为澄清、微褐色的溶液；测量折射指数，精确到小数点后第四位。25℃条件下，正确密度的BSA（1.080g/ml）的折射指数在1.384-1.385。为校正折射指数后，用试纸检测pH。pH应在7.0-7.4，一般无需调整。