小鼠脾脏树突细胞的分离－塑料黏附和EA玫瑰花结富集DC

实验材料：

1. 胶原酶消化的脾脏细胞悬液

2. 高密度牛血清白蛋白（BSA）溶液

3. RPMI 1640培养基（如Life Technologies），4℃和37℃

4. RPMI-5完全培养基，4℃和37℃

5. 抗体偶联的绵羊红细胞（EA）

6. 用于流式细胞分析的一抗

7. 用于流式细胞分析的二抗（荧光结合的小鼠抗大鼠IgG和IgM；如Boehringer Mannheim）

8. Beckman GH-3.7和Sorvall HS-4转子

9. 15ml和50ml聚丙烯锥底管

实验方法：

1. 将胶原酶消化的脾脏细胞悬液于4℃，280g离心10min，弃上清。用高密度BSA迅速重悬沉淀物，每个脾脏约1ml。

2. 准备BSA柱：将5-6ml细胞悬液加入15ml离心管中，在悬液上小心加入4℃ 1.5ml的RPMI-1640培养基，形成一明细界面。用此种方法准备4或5个BSA柱，直至分完细胞悬液。

3. 将BSA柱于4℃，9500g离心15min，缓慢加速，注意关掉“brake”开关。

4. 小心地用填充棉花的巴氏吸管收集分界面得细胞，吸走全部的RPMI-1640和顶部1ml BSA，将细胞转移至另一干净的50ml离心管中（弃沉淀）。用4℃的RPMI-1640充满离心管以稀释BSA，缓慢摇动混匀。

5. 于4℃，280g离心10min后弃上清。重悬细胞于5-10ml RPMI-5完全培养基后置于冰上。

6. 台盼蓝染色计数活细胞（一个脾脏可得到107 个低密度的脾脏细胞）。

7. 用RPMI-5完全培养基调整细胞密度至大约107 个细胞/ml。每4ml悬液接种至60mm培养皿内直至全部细胞铺板完毕。培养90min使DC粘附。

8. 弃非粘附细胞：用充填棉花的巴氏吸管吸取37℃ RPMI-1640培养基，小心清洗培养皿表面，去除悬浮的细胞，直至培养皿表面由粗糙浑浊变为光滑并近乎清亮。重复洗涤一次。

9. 每个培养皿加入4ml 37℃ RPMI-1640培养基并培养30-60min以去除粘附的淋巴细胞。重复步骤8。

10. 于倒置显微镜下利用相差观察培养皿。可见大部分深色星形树突细胞、一些明亮扁平的巨噬细胞，以及淋巴细胞、单核细胞之类的圆形细胞。如果树突细胞比例不高，则重复步骤8、9。

11. 用4ml干净的RPMI-5完全培养基替换每个培养皿中的液体，培养12-20h。

12. 用填充棉花的巴氏吸管吸取37℃ RPMI-5完全培养基洗涤平皿。将洗下来的细胞转移入置于冰上的15ml离心管中（每管可装3个平皿的洗涤细胞）。用2ml RPMI-5完全培养基洗涤平皿。重复该操作直到培养皿内的细胞收集完毕。

13. 将收集的细胞于4℃，280g离心10min，弃上清。用1ml干净的RPMI-5完全培养基重悬细胞后置于冰上。

14. 台盼蓝染色计数活细胞（0.5×106 -1.0×106 个细胞/脾脏，约80%为DC）。

15. 按每个白细胞50个EA（抗体偶联的绵羊红细胞）的量加入EA（以结合B细胞和巨噬细胞），颠倒混匀。4℃，70g离心10min。离心后不弃上清，直接将离心管置于冰上30min。

16. 吸弃部分培养基，剩下2-2.5ml。用填充棉花的巴氏吸管轻微吹打细胞悬液10-15次以吹散大的团块但是不破坏玫瑰花结。

17. 将重悬的细胞用血球计数器检查以确认是否每个玫瑰花结都是一个白细胞周围围绕着红细胞。如果有必要，再次悬浮细胞。

18. 制备BSA柱：将5ml高密度的BSA加入至15ml的离心管中，小心地将2.5ml玫瑰花结悬液加到液面上，从而形成一清晰地界面。

19. 离心并收集细胞同步骤3-6（2×105 -7×105 个细胞/脾脏，大于95%为DC）。

附录：

抗体偶联的绵羊红细胞（EA）：

以PBS洗涤2.5ml收集的绵羊红细胞（Alsever液中提取；Cocalico）3次，每次洗涤后均以350g离心5min。然后用新鲜PBS稀释为5%细胞悬浮液（109 个细胞/ml）。将高致敏的兔抗红细胞血清于5%细胞悬液以1：50稀释（可能形成亚凝集剂量的抗体）。

室温下孵育2h，偶尔温和地颠倒溶液。用RPMI1640（Life Technologies）洗涤形成的EA3次，随后以PBS将EA稀释为5%细胞悬液。于4℃保存2周，使用前再以RPMI洗涤一次。

RPMI-5完全培养基：

高密度BSA溶液：

在1L容量瓶中，加入186ml PBS，29ml 1mol/L NaOH，65ml水（小心操作，注意液体不要再瓶内飞溅）。不要搅拌，将106g BSA（Cohn fraction V，推荐采用完全BSA）铺在溶液表面，盖上锡纸，冷藏过夜，使BSA慢慢溶解。

第二天，温和摇晃已变为澄清、微褐色的溶液；测量折射指数，精确到小数点后第四位。25℃条件下，正确密度的BSA（1.080g/ml）的折射指数在1.384-1.385。为校正折射指数后，用试纸检测pH。pH应在7.0-7.4，一般无需调整。