慢病毒制备步骤及注意事项

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现今常用的制备慢病毒载体 的方法为使用3或者4质粒系统转染293T细胞。此外，也有使用其它几类慢病毒包装细胞系制备慢病毒载体。

瞬时转染制备慢病毒 ：

细胞：慢病毒包装常用人胚肾细胞(HEK, human embryonic kidney)293 T，其含有SV40病毒的大T抗原蛋白编码基因，转染效率极高。但其贴壁性不好，所以需要使用多聚赖氨酸包被的培养皿增加其吸附性。多聚赖氨酸培养皿可购买，也可自行制备。转染前，细胞密度控制在40-70%比较好。

DNA：每10 cm培养皿约含5x106 293T细胞，需用30-40 ug不含内毒素的质粒进行转染。质粒的纯度对慢病毒载体的包装效率非常关键。不同的包膜蛋白表达载体，其使用量也不同。

转染：最经济的转染方法是磷酸钙转染法，虽然其溶液配置影响因素多，不易稳定重复得到最佳的转染结果。其它方法有脂质体法和PEI法。转染48-60后可以收集上清，通过低速离心，然后滤膜过滤可以去除上清中的细胞碎片。

如果使用VSV-G包膜蛋白的话，可以通过两次超速离心进行浓缩，从而最高可以获得滴度高达1011-1012IU/ml的慢病毒载体。之后可以将病毒载体溶解在PBS， HBSS或者DMEM中，并置于-800C储存。

储存溶液添加血清会帮助提高病毒冻融时的存活率，然而有些病毒在侵染细胞时，血清会有干扰，所以需要依据具体病毒种类考虑是否添加血清。

病毒滴度：含VSV-G的慢病毒载体，其滴度在浓缩前一般为107IU/ml，浓缩之后可以达到109-107IU/ml 。

含有荧光标记或者其它报告基因的病毒载体，可以通过梯度稀释侵染HeLa或者293，NIH3T3细胞来确定其滴度;不含报告基因的可通过测定病毒颗粒中相关病毒蛋白的活性或者含量来确定其滴度，比如使用p24gag的ELISA试剂盒。一般来说，每4-60 x 103个病毒载体含1ng p24gag。

然而这种方法测出来的滴度并不准确，不同的病毒载体类型，不同的储存方式，都会导致p24gag和病毒载体颗粒的比值变化较大。

甚至是不同的实验室测出来的都会有差异。亦可使用PCR法测定滴度，其引物设计针对病毒颗粒的通用cDNA区域，因此不受外源插入片段的影响，也不需要反转录步骤，而且可以用于所有慢病毒载体。

注意事项

1.避免使用小量抽提质粒，其纯度相比中抽和大抽而来的质粒纯度较低，可能会降低包装效率。

2.对于基于HIV-1的慢病毒载体而言，依实验目的，可能需要Vpr或者Rev辅助蛋白因子。有些细胞类型需要这些辅助蛋白的参与才能达到高侵染效率。

3.包装细胞系的质量对高效包装病毒非常关键。转染时，细胞密度在40-60%之间比较合适，过低或者过高密度都可能会降低病毒包装效率。细胞开始出现汇合时，需要及时更换或者添加新鲜培养基以保持细胞健康状态。

4.氯喹对细胞有毒性，一般将标准使用浓度之下的氯喹与细胞共孵育的时间控制在8小时之内。或者降低氯喹的使用浓度，延长孵育时间。

5.病毒包装时的细胞培养温度需要综合两方面因素考虑：a)，370C最有利于保持细胞健康状态;b)，320C最有利于维持重组病毒的稳定性。

6，收集病毒上清时的离心步骤可以去除细胞碎片以及少数悬浮的293T细胞。必要时，需要过滤以彻底去除一些细胞成分的污染。

7.冻融会降低病毒侵染效率50%，因此需要避免多次反复冻融。病毒放置于40C时每36-48小时侵染效率下降50%。

8.视实验目的而定，为降低血清成分污染，建议使用低浓度血清培养基。

9.通过使用0.45mm的滤膜不仅可以去除细胞碎片残留，还可以去除VSV-G残留片段对细胞的毒性影响，但同时也会部分影响病毒滴度，所以过滤步骤需要依据具体实验目的而定。

10.使用TNE重悬病毒沉淀时，虽然低体积会增加病毒浓度，然而由于VSV-G介导病毒与细胞的融合，所以高浓度VSV-G对细胞会造成一定毒性，而有些细胞对VSV-G引起的毒性比较敏感，因此最终体积需要依据具体实验而定。

11.超离心纯化病毒步骤可以重复二次，第二次可以使用培养基而不是TNE溶液重悬病毒。

12.使用病毒载体侵染细胞时，细胞密度对侵染效率有较大影响。细胞汇合密度过高会降低侵染效率。

13.侵染所使用的病毒载体体积和病毒滴度，病毒载体的质量以及靶细胞种类有关。

14.使用polybrene之后，需要更换新鲜培养基，因为polybrene对细胞有毒性作用。少数细胞会特别敏感，因此不同细胞polybrene的最佳作用浓度和时间都有所不一样。

15.针对悬浮培养细胞的病毒载体侵染，建议使用Spin Infection方法，此法对于侵染效率低的贴壁细胞同样有帮助。