悬浮培养技术在生物制药中的应用和展望

【摘要】细胞悬浮培养是利用生物反应器大规模培养动物细胞生产生物制品的核心技术，结合筛选驯化的高表达细胞株和个性化细胞培养基，控制细胞培养过程，实现提高生产效率及产品质量、降低生产成本的目的，是当前国际上生物制品生产的主流模式。

但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。

随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。本文就国内外细胞悬浮培养产业化发展现状及其关键技术进行介绍和讨论。

目前，国内生物疫苗生产企业生产细胞培养的抗原时，普遍采用传统的转瓶细胞培养工艺，该方法培养细胞存在密度低、病毒产率低、生产成本高、劳动强度大等缺点。

诞生于上个世纪六十年代的悬浮培养技术可以进行大规模细胞培养，获得大量的病毒产物及高质量的疫苗产品，在国外疫苗生产中普遍应用。

悬浮培养技术是指在生物反应器中，人工条件下高密度大规模培养动物细胞用于生物制品生产的技术，根据细胞是否贴壁，分为悬浮细胞培养和贴壁细胞微载体悬浮培养。

悬浮培养技术最大优势是通过更为精确有效的工艺控制手段，在获得最大产量的同时还能稳步提高产品的质量。下面就悬浮培养产业化的关键技术及相关问题进行介绍和探讨。

1962年，Capstick等对BHK21细胞驯化实现悬浮培养，并用于兽用疫苗生产。1967年，Van Wezel开发了微载体并实现在生物反应器中大规模培养贴壁细胞。悬浮培养与微载体培养标志着细胞大规模培养技术的开始，细胞生产病毒疫苗也成为细胞大规模培养技术生产生物制品的第一次浪潮。

到了20世纪八九十年代，CHO细胞实现悬浮培养，治疗性抗体生产技术的发展极大地推动着生物反应器在生物制药行业中的应用，到20世纪末已进入万升级规模[1]。2000年以后，随着流加培养、灌注培养、个性化细胞培养基等技术的发展，作为大规模培养主要设备的生物反应器规模也趋向大型化和简单化。

现在，全球10000L及以上体积的反应器达一百多台，最大已达25000L，且几乎都是可以放大的机械搅拌式反应器，主要为Genetech、Amgen、BoehringerIngelheim 和Lonza等公司所拥有。当今生物制药的主流技术是在大型机械搅拌式反应器中，用无血清培养基和流加培养工艺悬浮培养细胞进行生产[2]。

动物细胞大规模培养生产生物制品的应用领域在快速发展。2007年全球销售额最高的6大类生物技术药物中，有5类是经哺乳动物细胞表达生产的[3]。

现代基因工程技术及个性化培养基技术的发展，促进细胞培养制药的快速进展，例如开发出MDCK细胞在反应器中悬浮培养生产流感疫苗以代替传统的鸡胚生产，10 L密度为106个/ml的细胞产能相当于10000只鸡胚的产量[4]。

国际知名厂家纷纷进行细胞改造筛选，发展自己的细胞培养平台进行流感疫苗的生产，如Baxter公司的Vero细胞平台、Crucell公司和赛诺菲巴斯德的PER-C6细胞平台，诺华公司的MDCK细胞平台等[5]

反观国内，人用和兽用疫苗生产企业超过110家，应用反应器悬浮培养技术生产疫苗的仅4家，其中生产人用疫苗的企业有辽宁成大等3家，规模是数十台14 L-30 L进口反应器；兽用疫苗企业中金宇集团采用清大天一自主开发的CLAVORUS®650 L和1200 L反应器生产口蹄疫疫苗[6]。

在治疗性抗体生产方面，有2家企业采用进口1000 L-3000 L生物反应器生产，但与国外万升级规模相比还具有较大的差距。

我国“七五”至“八五”攻关期间立题研发动物细胞生物反应器，由于细胞培养技术要求高、壁垒大，研发单位在未掌握核心技术的情况下，凭模仿很难实现产业化，国产细胞生物反应器在2008年以前几乎是空白。

此外，由于细胞株等上游配套技术落后、缺乏个性化细胞培养基支持以及缺乏生化工程研究等原因，大规模细胞培养技术一直难以突破技术瓶颈[7]。据《中国生物技术产业发展报告（2005）》分析可见：自主综合支撑技术是大规模悬浮培养技术在我国实现产业化最难以跨越的技术“门槛”。

为提高生物制品的产率和安全有效性，在生物反应器中繁殖的病毒与细胞需要进行相互适应选择，针对不同的毒株及其表达量筛选适合的宿主细胞对于细胞大规模生产具有重要的意义。

根据毒株特性，综合考虑所用毒株能在何种细胞上增殖、表达，是悬浮还是贴壁细胞，是否适合大规模培养，规模和技术是否影响表达的稳定性，能否进行驯化，驯化后毒株的敏感性和表达量是否有变化等因素选择合适的宿主细胞。

因此，细胞和毒株的筛选驯化尤为重要。尤其是贴壁细胞，因微载体悬浮培养比全悬浮培养成本高，所以一些国际知名企业对Vero细胞、MDCK细胞及PER-C6细胞进行悬浮化[4,5]培养并已获成功。

细胞筛选驯化的实质是应用现代细胞生物学技术，在降低细胞凋亡率、提高细胞活力、延长细胞生命周期、提高产物浓度等方面进行研究，结合特定细胞的营养需求进行培养基优化，筛选适用于生产的细胞株。

Lonza公司在2005年采用普通的CHOK1细胞株和进行转染克隆筛选后的悬浮突变细胞株CHOK1SV的表达蛋白能力进行对比，发现筛选后的蛋白表达能力提高了4-5倍[2]。Chia chu等也是通过转染技术、克隆筛选出悬浮的MDCK细胞株[4]。

为实现稳定的驯化，通常由高密度细胞培养向低密度细胞培养，由高浓度血清培养逐渐降低血清浓度进行培养。因细胞损伤后难以修复，所以驯化时细胞活力应保持在90%以上。细胞的增殖能力直接影响产能，驯化时应保持对其增殖能力的测定。

细胞驯化时还应对其表达分泌能力进行测定，避免驯化后的细胞表达特性发生变化。驯化后细胞的增殖能力、活力及生产能力要能够满足工业大规模生产。

由于特定细胞的营养需求不同，实现其驯化的难易程度也不同，在驯化时选用合适的细胞培养基至关重要，有针对性地补充某些营养成分以满足细胞的特定需求，使驯化好的细胞可以保持其悬浮或是无血清生长的特性。与20世纪80年代相比，由于细胞培养基技术的发展，细胞驯化变得相对容易。

培养动物细胞的目的是获得足够量的病毒，因此，毒株对细胞的敏感性非常重要。但在实际应用中，毒株对细胞的敏感性差异性较大。

不同细胞对同一病毒敏感性不同，同一细胞对不同病毒株敏感性不同；悬浮细胞和贴壁细胞的敏感性不同；同一病毒株可在多种宿主细胞上生长，一种细胞系平台也可能生产多种病毒；同一细胞不同培养方式病毒量、抗原结构、免疫源性、毒力等也可能不同。

如狂犬病毒PM毒株从兔脊髓生产，发展到脑组织，人二倍体细胞株、MRC-5细胞、MDCK适应到现在的Vero细胞，使得狂犬疫苗的生产率明显提高；而狂犬病毒Flury LEP株从最初的鸡胚细胞生产发展到BHK21细胞生产并进一步适应了反应器悬浮培养等。

在优化培养工艺的基础上，作为种源的毒株及相应细胞株的筛选优化，提高细胞培养的质量和病毒表达量已是当前提高产率的一个技术要点，也是降低成本、提高生产竞争力的关键之一。诺华公司采用来自于ATCC的血清依赖型MDCK细胞株进行驯化筛选，形成了在无血清无蛋白条件下悬浮培养的流感病毒专用MDCK细胞株[5]

瑞士联邦科技学会生物工艺学教授Wurm博士在2005年指出：“培养基虽不是细胞培养中唯一重要因素，但确是最重要的一种”[8]。尤其在大规模培养技术中，维持细胞高密度甚至无血清生长，培养基的营养含量对细胞的增殖、维持尤为重要。

在悬浮培养技术中，不同细胞营养代谢的特异性不同，细胞和病毒培养工艺不同，需要抗剪切力及满足放大功能，还需要提高目标生物制品的稳定性、表达量，这些均需要个性化培养基的支持。

LONZA公司2005年研究结果表明，采用优化后的限定化学成分培养基与目录培养基相比，蛋白表达量提高了9.6倍[2,9]。可见生产中细胞培养基的优化对于提高产物表达量的重要性。

个性化培养基在国外生物制品生产中普遍采用，生物制药公司往往与细胞培养基企业建立一种“合同服务”关系，研制最适合的个性化细胞培养基用于生产，由细胞培养基企业为用户提供细胞培养基定制以及相关技术支持，帮助他们最大程度地提高生产效率[10]。

为用户定制细胞培养基为世界几大细胞培养基制造商业务的主要部分，而公开的目录培养基产品仅占其业务的10-30%[11]。

细胞培养基经过天然培养基、合成培养基，发展到无血清培养基、无蛋白培养基、限定化学成分培养基，近百年的发展，已发生质的飞跃。

无血清培养基杜绝了血清的外源性污染和对细胞毒性作用，使产品易于纯化、回收率高；其成分明确，有利于研究细胞的生理调节机制；还可根据不同细胞株设计和优化适合其高密度生长或高水平表达的培养基[12]。

从对人类和动物安全性的长远考虑，生物制品生产越来越倾向采用无血清无动物组分培养基，国际上生物制药生产中，已经有50%以上采用无血清、无蛋白培养基[13]。

微载体对细胞附着、细胞的进一步扩展和重组蛋白的表达有较大影响。常见的微载体有实体的Cytodex微载体、片状的DISK微载体及多孔的Cytopore微载体。

使用DISK或Cytopore时细胞贴附于载体内部生长，表面细胞较少，难以使用细胞消化等方法将载体和细胞进行分离，且反应器放大工艺困难，不适合非释放病毒的培养。

而Cytodex比较适应罐倒罐的反应器放大工艺，目前报道的贴壁细胞生产工艺的最佳形式是机械搅拌式微载体悬浮培养系统，可实现最有效的优化工艺和最适宜的工艺设计，其最佳工艺设计体现于高密度连续灌流培养[10]。清大天一在微载体悬浮培养Vero细胞、MARC145细胞和ST细胞等工艺技术方面同样取得了较好的进展。

悬浮细胞培养工艺按照培养方式分为批培养、流加培养及灌注培养。批培养能直观反映细胞在生物反应器中的生长、代谢变化，操作简单，但初期代谢废产物较多，抑制细胞生长，细胞生长密度不高。

流加培养操作简单、产率高、容易放大，应用广泛，但需要进行流加培养基的设计。灌注培养的培养体积小，回收体积大，产品在罐内停留时间短，可及时回收到低温下保存，利于保持产品的活性，但操作比较繁杂、培养基利用效率低、旋转过滤器容易堵塞。

不同的病毒采用的培养方式不同，如对于分泌型且产品活性降低较快的生物制品，宜采用灌注培养，且灌注培养也更适宜于微载体培养。

同一生物制品由于其营养环境的不同，其生产工艺也可能发生变化，如BHK21细胞生产口蹄疫病毒，在有血清培养时采用批培养，接毒前需要更换无血清的维持液；而无血清培养过程中无需进行换液，但流加培养可能效果更好。

选择反应器悬浮培养工艺需要考察的几个因素：细胞和病毒的关系、产物稳定性、培养基或添加物的选择、培养规模等。当前FDA批准的主流生产工艺是在机械搅拌式生物反应器中采用流加培养工艺，工艺优化主要集中在流加策略的应用。

如前所述，国际上反应器悬浮培养技术已广泛用于生物制药生产，且在不断发展，研究热点集中在高表达细胞株的构建、个性化培养基的研发等。大量新建反应器和产物表达量的提高已导致反应器容量过剩，发达国家市场出现饱和、向发展中国家扩展的趋势。

各大生物制药巨头开始通过合作或收购等方式进入新兴的中国市场，如赛诺菲-安万特看中中国兼具研发和新兴市场这两种特质，在药品研发、生产、包括动物疫苗生产等领域在中国进行了大量投资；另一家制药巨头诺华公司在2009年底，通过收购中国第二大甲流疫苗供应商—浙江天元生物股权，快速进军中国疫苗行业。

应该认识到，快速实现悬浮培养技术在疫苗生产中的应用只是搭建了一个升级的工艺平台，而不是最终目的，行业和企业发展真正的动力是新药、新疫苗、新工艺以及配套技术的创新。

例如： 无血清培养病毒生产技术的开发，包括无血清培养基的开发；利用合适的培养基和转染或驯化技术实现贴壁细胞的悬浮培养构建；

新宿主细胞表达品种开发，如同一种产品采用新的宿主细胞表达或是开发一种高效表达的宿主细胞适应几种产品的表达；

利用基因工程技术，开发更安全的疫苗品种；以及 生物制品相关的关键技术和产品国产化，如个性化细胞培养基、生物反应器、微载体、纯化装置、佐剂等。

整合行业力量，快速实现悬浮培养技术在疫苗生产中的升级换代是未来几年我国生物制药行业发展的重点，这个过程应重视成熟技术、成功率，以减少和避免时间、资金、人力等资源的浪费，减少机会成本，抢占市场先机。

悬浮培养技术的升级将导致行业整合与重组，生物制药行业将出现明显的集约化趋势，有实力的企业将不断以创新新药、新技术研发为基础和核心竞争力，同时借助资金实力整合制造和营销体系，成为真正意义上的龙头。