生物芯片技术的应用与展望
丁香园论坛
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生物芯片技术的应用与展望
自1998年美国宣布正式启动基因芯片计划以来,生物芯片技术的理论研究与实际应用在国内外迅速发展,已经成为人们高效、准确、大规模地获取相关信息的重要手段之一,生物芯片技术是生命科学研究中继基因克隆技术、基因自动测序技术、PCR技术后的又一次革命性技术突破。生物芯片技术通过微加工和微电子技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析系统,即通过缩微技术将生命科学研究中许多不连续的分析过程集成于硅片、玻璃片或陶片等固相密质载体上,形成生物分子点阵,在待分析样品中的生物分子与生物芯片的探针分子发生相互作用后,对作用信号进行检测和分析。在此基础上发展的微流体芯片,则是将整个生化分析过程集成于芯片表面,从而实现对DNA,RNA,多肽,蛋白质及其他生物成分进行高通量检测,它是将生命科学研究中所涉及的许多分析步骤,利用微电子、微机械、化学、物理技术、传感器技术、计算机技术,使样品检测、分析过程连续化、集成化、微型化。
一．生物芯片的种类
1．根据支持介质划分制备芯片的固相介质有玻片硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等，在选择固相介质时,应考虑其荧光背景的大小、化学稳定性、结构复杂性、介质对化学修饰作用的反应,介质表面积及其承载能力以及非特异吸附的程度等因素，目前较为常用的支持介质是玻片,无论是原位合成法还是合成点样法都可以使用玻片作其固相介质,而且在制备芯片前对该介质的预处理也相对简单易行。
2．根据制备方法划分芯片制备的方法主要有原位合成与合成点样，其中原位合成又可分为光引导聚合法和喷墨打印合成法(压电打印法)，光引导聚合法在合成前需先对介质进行处理,使之衍生出羟基或氨基并与光敏保护基建立共价连接,合成单体的一端用固相合成法活化,另一端与光敏保护基相连，在合成反应过程中,通过蔽光膜使特定的位点透光,其余位点不透光,只有受光的位点才能脱掉保护基并与特定单体活化端相连,单体的光敏保护端露出,经过若干上述循环反应后,使每个位点按需要合成特定序列的探针,其中每次合成反应中哪些位点上连接哪种单体,由更换不同的蔽光膜来控制[1]，喷墨打印合成法的原理类似于喷墨打印机,通过4个喷印头将4种碱基按序列要求依次喷印在芯片的特定位点上，合成点样法是指将预先合成好的探针用点样机点到介质上,点样前需将介质表面包被氨基硅烷或多聚赖氨酸,使之带上正电荷来吸附核酸分子"除上述种方法外,还有用聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质,将胶块(4
Lm@40Lm@20Lm间隔80Lm,或100Lm@100Lm@20Lm间隔200Lm)固定在玻璃上,然后将合成好的不同探针分别加到不同的胶块上,制成以凝胶块为阵点的芯片[2],或者也可以通过导电的吡咯单体的聚合形成微阵列，其基本原理是:在硅片上镀一层500nm厚的金层,通过蚀刻技术在硅片上形成金2微电极,吡咯单体经过聚合在微电极上形成一层聚吡咯膜,其中与吡咯单体相连的探针在吡咯的聚合过程中连到电极上,每种探针的位置通过特定电极的开启与关闭来控制[3,4]"Ferguson等[5]还利用光纤束建立了光纤生物传感微阵列,它是将每根光纤维(直径200Lm)的一端共价连接上寡核苷酸探针,然后将这些连有不同寡核苷酸探针的光纤维装配成光纤束,构成光纤微阵列，检测时只需将光纤束连有不同探针的一端直接浸入靶样品溶液中即可,产生的荧光杂交信号可通过光纤维传导至光纤束的另一端,并通过荧光显
微电荷偶联摄影系统对传导过来的信号进行检测。
3．根据芯片上的探针划分按芯片上探针的不同,生物芯片可分为基因芯片和蛋白芯片，如果芯片上固定的分子是寡核甘酸探针或靶DNA,则称为基因芯片;如果芯片上固定的是肽或蛋白,则称为肽芯片或蛋白芯片，其中基因芯片又包括模式和模式两种,模式是指将靶DNA固定于支持物上,适合于大量不同靶DNA的分析;模式是将大量探针分子固定于支持物上,适合于对同一靶DNA进行不同探针序列的分析。
二． 生物芯片技术的应用
在基础医学研究方面,生物芯片中最成熟的基因芯片技术可用于基因表达谱研究、基因突变研究、基因组分型及测序和重测序等方面。生物芯片还成功应用于食品科学和医学药物筛选等领域,发挥出前所未有的巨大作用。
1．生物芯片在基因结构与功能研究上的应用
将大量的功能基因点于芯片上,制成表达谱芯片,用各类组织的样品与之杂交,从中对基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化特异性、病变特异性和刺激特异性表达进行分析和判断,可以将某些基因与疾病联系起来,极大地加快这些基因功能的确立,同时,进一步研究基因与基因间相互作用的关系。
1．1基因测序与基因表达分析
德国一所大学成功地利用肽核酸生物传感器芯片进行DNA测序,通过检测DNA上的磷酸基团,证实了使用时间飞行二次离子质谱技术可以很容易地鉴别杂交到肽核酸生物传感器芯片上的DNA。研究还显示,该技术在基因诊断方面具有很大的应用潜力。Cloud等人利用激光捕捉显微切割技术,联合蛋白质芯片研究了正常人、结肠癌病人、癌转移病人结肠组织蛋白
的表达情况,发现了不同的表达图谱。Tarui等人用DNA芯片分析了烧伤病人淋巴细胞中细胞因子基因的表达情况,发现IFNrR1,IL1R1,-2Rh,-2Ra,-2Rr,-6Ra和-7R降低,IFN-r,IL-1a,-13和-15表达升高,从而为烧伤病人的治疗提供依据。Song等人绘制了早幼粒细胞性白血病HL-60细胞向单核细胞或者粒细胞分化过程中的一些肿瘤相关基因的表达谱。
1．2基因突变和多态性检测分析基因突变和单核苷酸多态性(SNP)最有效、应用最广泛的方法是用等位基因特异的寡核苷酸探针进行示差杂交。Weidong所在的研究小组报道了一种分析人类线粒体tRNA单核苷酸多态性的方法,他们采用一种称为“XNAonGoldChip”的技术平台,把一系列各含有一个碱基突变的等位基因特异性探针固定于芯片上,分别与荧光标记的参考核酸及样本扩增产物杂交,通过分析杂交信号进行SNP的检测。
2．生物芯片在食品科学上的应用
2．1转基因食品的检测
近年来,人们对转基因食品的安全性问题争议很大。传统的测试方法如PCR扩增法、化学组织检测法等,一次只能对一种转基因成分进行检测,且存在假阳性高和周期长等问题。而采用基因芯片技术仅靠一个实验就能筛选出大量的转基因食品,因此,被认为是最具潜力的检测手段之一。Rudi等人研制出一种基于PCR的复合定性DNA阵列,并将其用于检测转基因玉米。结果表明:此方法能够快速地,定量地检测出样品中10%～20%的转基因成分,因而,被认为适于将来GMO检测的需要。此外,Mariotti等人发明了一种用于转基因食品检测的基于DNA杂交原理的生物芯片SPR(surfaceplasmonres2onance),可定量出样品中含2%的转基因大豆粉。
2．2食品中微生物的检测
Appelbaum在对几种细菌进行鉴别时,设计了一种鉴别诊断芯片,一方面从高度保守基因序列出发,即以各菌种间的差异序列为靶基因,另一方面,选择同种细菌不同血清型所特有的标志基因为靶基因,固着于芯片表面,同时,还含有细菌所共有的16SrDNA保守序列以确定为细菌感染标志。Keramas等人利用基因芯片能直接将来自鸡粪便中的2种十分相近的Campylobacter菌种Campylobactejejuni和Campylobactecoil检测并区分开来,而且,检测速度快、灵敏度高、专一性强,这给诊断和防治禽流感疫情提供了有利的工具。
2．3食品卫生检验
食品营养成分的分析、食品中有毒、有害化学物质的分析、食品中生物毒素(细菌、真菌毒素等)的监督检测工作都可以用生物芯片来完成,一张芯片一次可对水中可能存在常见致病菌进行全面、系统检测与鉴定,且操作简便、快捷。
3．生物芯片在医学中的应用
3．1在疾病诊断中的应用
Wen等人分别用寡核苷酸微阵列P53基因芯片和传统的DNA测序分析法检测77例卵巢癌病人的TP53基因,前者检测出71例病人的TP53基因发生突变,而后者只检出63例,与DNA测序分析87%的准确率比较,寡核苷酸微阵列高达94%。前者敏感度为92%,后者为82%,两
者特异性均为100%,证明生物芯片技术是一种快速有效的检测突变的工具。Elek等人从正常人和3个独立的前列腺癌患者体内提取Mrna,将其反转录成cDNA后制备成含588个基因
的微阵列,并将其用于基因差异表达分析,发现其中至少19个基因在肿瘤及正常组织中差异表达,提示微阵列与相关cDNA库结合,能促进对诊断和治疗前列腺癌及其他肿瘤的潜在靶点的快速鉴定。而Lehman等人使用Affy2metrix公司的P53基因芯片检测了家族性乳腺癌病人P53的突变,发现除了外显子外,在这些患者中还存在P53内含子的突变,而且,是高频率的并伴有功能性活动。在血液病的检测领域还有报道Kurg等人用DNA芯片分析了10例β地中海贫血的基因突变,其中,9个病人的DNA样品中都携带一个不同的突变,而且,还正确鉴定
出4例野生型DNA样品,平均的信噪比是40∶1,这使得突变的高准确性检测成为可能,并且,适用于大面积病人的筛查。
3．2生物芯片在疫苗研制中的应用
意大利的研究人员Grifantini等人利用DNA微阵列技术研究了B群脑膜炎双球菌与人上皮细胞相互作用过程中所发生的基因调控情况,他们发现,在细菌与上皮细胞相互作用中涉及347个基因,其中,30%的基因编码功能还不清楚的蛋白。上调基因包括那些在铁、氯化物、氨基酸、硫酸盐转运过程中涉及的基因、编码众多毒力因子的基因以及含硫氨基酸循环过程中所涉及的基因。有189个上调基因,其中,75个编码表面蛋白,12种蛋白是诱导粘附的表面抗原,5种表面抗原在实验鼠身上可以诱导杀菌抗体,似乎可以成为有效的候选疫苗。由此表明:微阵列技术是鉴定新的候选疫苗的有力策略。Hayward等人利用得自恶性疟原虫绿豆核酸酶基因库的随机插入片段,构建了“鸟枪DNA芯片”,通过示差杂交和克隆测序,发现疟原虫血液期滋养体与有性期配子体之间基因表达差异很大,此项结果大大有助于研制防止疟
原虫传播的阻断剂和设计针对血液期抗原的疫苗。此外,生物芯片技术在药物筛选、遗传药理学、毒理学和病毒感染的快速诊断等领域也有许多成功应用的例子。
四．生物芯片的应用前景
生物芯片技术因其可在一次反应中进行多种信息的平行分析,而受到众多研究者的瞩目,特别是基因芯片在人类基因组计划的研究工作中的应用,不仅极大地促进了该项工作的进行,也使芯片技术在短短的几年间得到了长足的发展,并迅速在杂交测序以外的领域得到广泛的应用,如上所述在基因结构与功能研究上的应用，在食品科学上的应用，在疾病的基因诊断等，但该技术成本高,芯片的制备比较复杂,样品的准备与标记较为繁琐,且其信号检测的灵敏度也有待于进一步提高,这些问题使得该技术的普及与进一步推广存在一定的难度，目前国外正在致力于这些问题的解决与研究,国内也有研究者正在积极地开展该项研究工作，我们有理由相信,随着该技术的不断完善与发展,在将来,无论是基因芯片还是蛋白芯片都会作为一种简便快捷的技术,为我们的研究工作与临床检测带来极大的便利。
自1998年美国宣布正式启动基因芯片计划以来,生物芯片技术的理论研究与实际应用在国内外迅速发展,已经成为人们高效、准确、大规模地获取相关信息的重要手段之一,生物芯片技术是生命科学研究中继基因克隆技术、基因自动测序技术、PCR技术后的又一次革命性技术突破。生物芯片技术通过微加工和微电子技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析系统,即通过缩微技术将生命科学研究中许多不连续的分析过程集成于硅片、玻璃片或陶片等固相密质载体上,形成生物分子点阵,在待分析样品中的生物分子与生物芯片的探针分子发生相互作用后,对作用信号进行检测和分析。在此基础上发展的微流体芯片,则是将整个生化分析过程集成于芯片表面,从而实现对DNA,RNA,多肽,蛋白质及其他生物成分进行高通量检测,它是将生命科学研究中所涉及的许多分析步骤,利用微电子、微机械、化学、物理技术、传感器技术、计算机技术,使样品检测、分析过程连续化、集成化、微型化。
一．生物芯片的种类
1．根据支持介质划分制备芯片的固相介质有玻片硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等，在选择固相介质时,应考虑其荧光背景的大小、化学稳定性、结构复杂性、介质对化学修饰作用的反应,介质表面积及其承载能力以及非特异吸附的程度等因素，目前较为常用的支持介质是玻片,无论是原位合成法还是合成点样法都可以使用玻片作其固相介质,而且在制备芯片前对该介质的预处理也相对简单易行。
2．根据制备方法划分芯片制备的方法主要有原位合成与合成点样，其中原位合成又可分为光引导聚合法和喷墨打印合成法(压电打印法)，光引导聚合法在合成前需先对介质进行处理,使之衍生出羟基或氨基并与光敏保护基建立共价连接,合成单体的一端用固相合成法活化,另一端与光敏保护基相连，在合成反应过程中,通过蔽光膜使特定的位点透光,其余位点不透光,只有受光的位点才能脱掉保护基并与特定单体活化端相连,单体的光敏保护端露出,经过若干上述循环反应后,使每个位点按需要合成特定序列的探针,其中每次合成反应中哪些位点上连接哪种单体,由更换不同的蔽光膜来控制[1]，喷墨打印合成法的原理类似于喷墨打印机,通过4个喷印头将4种碱基按序列要求依次喷印在芯片的特定位点上，合成点样法是指将预先合成好的探针用点样机点到介质上,点样前需将介质表面包被氨基硅烷或多聚赖氨酸,使之带上正电荷来吸附核酸分子"除上述种方法外,还有用聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质,将胶块(4
Lm@40Lm@20Lm间隔80Lm,或100Lm@100Lm@20Lm间隔200Lm)固定在玻璃上,然后将合成好的不同探针分别加到不同的胶块上,制成以凝胶块为阵点的芯片[2],或者也可以通过导电的吡咯单体的聚合形成微阵列，其基本原理是:在硅片上镀一层500nm厚的金层,通过蚀刻技术在硅片上形成金2微电极,吡咯单体经过聚合在微电极上形成一层聚吡咯膜,其中与吡咯单体相连的探针在吡咯的聚合过程中连到电极上,每种探针的位置通过特定电极的开启与关闭来控制[3,4]"Ferguson等[5]还利用光纤束建立了光纤生物传感微阵列,它是将每根光纤维(直径200Lm)的一端共价连接上寡核苷酸探针,然后将这些连有不同寡核苷酸探针的光纤维装配成光纤束,构成光纤微阵列，检测时只需将光纤束连有不同探针的一端直接浸入靶样品溶液中即可,产生的荧光杂交信号可通过光纤维传导至光纤束的另一端,并通过荧光显
微电荷偶联摄影系统对传导过来的信号进行检测。
3．根据芯片上的探针划分按芯片上探针的不同,生物芯片可分为基因芯片和蛋白芯片，如果芯片上固定的分子是寡核甘酸探针或靶DNA,则称为基因芯片;如果芯片上固定的是肽或蛋白,则称为肽芯片或蛋白芯片，其中基因芯片又包括模式和模式两种,模式是指将靶DNA固定于支持物上,适合于大量不同靶DNA的分析;模式是将大量探针分子固定于支持物上,适合于对同一靶DNA进行不同探针序列的分析。
二． 生物芯片技术的应用
在基础医学研究方面,生物芯片中最成熟的基因芯片技术可用于基因表达谱研究、基因突变研究、基因组分型及测序和重测序等方面。生物芯片还成功应用于食品科学和医学药物筛选等领域,发挥出前所未有的巨大作用。
1．生物芯片在基因结构与功能研究上的应用
将大量的功能基因点于芯片上,制成表达谱芯片,用各类组织的样品与之杂交,从中对基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化特异性、病变特异性和刺激特异性表达进行分析和判断,可以将某些基因与疾病联系起来,极大地加快这些基因功能的确立,同时,进一步研究基因与基因间相互作用的关系。
1．1基因测序与基因表达分析
德国一所大学成功地利用肽核酸生物传感器芯片进行DNA测序,通过检测DNA上的磷酸基团,证实了使用时间飞行二次离子质谱技术可以很容易地鉴别杂交到肽核酸生物传感器芯片上的DNA。研究还显示,该技术在基因诊断方面具有很大的应用潜力。Cloud等人利用激光捕捉显微切割技术,联合蛋白质芯片研究了正常人、结肠癌病人、癌转移病人结肠组织蛋白
的表达情况,发现了不同的表达图谱。Tarui等人用DNA芯片分析了烧伤病人淋巴细胞中细胞因子基因的表达情况,发现IFNrR1,IL1R1,-2Rh,-2Ra,-2Rr,-6Ra和-7R降低,IFN-r,IL-1a,-13和-15表达升高,从而为烧伤病人的治疗提供依据。Song等人绘制了早幼粒细胞性白血病HL-60细胞向单核细胞或者粒细胞分化过程中的一些肿瘤相关基因的表达谱。
1．2基因突变和多态性检测分析基因突变和单核苷酸多态性(SNP)最有效、应用最广泛的方法是用等位基因特异的寡核苷酸探针进行示差杂交。Weidong所在的研究小组报道了一种分析人类线粒体tRNA单核苷酸多态性的方法,他们采用一种称为“XNAonGoldChip”的技术平台,把一系列各含有一个碱基突变的等位基因特异性探针固定于芯片上,分别与荧光标记的参考核酸及样本扩增产物杂交,通过分析杂交信号进行SNP的检测。
2．生物芯片在食品科学上的应用
2．1转基因食品的检测
近年来,人们对转基因食品的安全性问题争议很大。传统的测试方法如PCR扩增法、化学组织检测法等,一次只能对一种转基因成分进行检测,且存在假阳性高和周期长等问题。而采用基因芯片技术仅靠一个实验就能筛选出大量的转基因食品,因此,被认为是最具潜力的检测手段之一。Rudi等人研制出一种基于PCR的复合定性DNA阵列,并将其用于检测转基因玉米。结果表明:此方法能够快速地,定量地检测出样品中10%～20%的转基因成分,因而,被认为适于将来GMO检测的需要。此外,Mariotti等人发明了一种用于转基因食品检测的基于DNA杂交原理的生物芯片SPR(surfaceplasmonres2onance),可定量出样品中含2%的转基因大豆粉。
2．2食品中微生物的检测
Appelbaum在对几种细菌进行鉴别时,设计了一种鉴别诊断芯片,一方面从高度保守基因序列出发,即以各菌种间的差异序列为靶基因,另一方面,选择同种细菌不同血清型所特有的标志基因为靶基因,固着于芯片表面,同时,还含有细菌所共有的16SrDNA保守序列以确定为细菌感染标志。Keramas等人利用基因芯片能直接将来自鸡粪便中的2种十分相近的Campylobacter菌种Campylobactejejuni和Campylobactecoil检测并区分开来,而且,检测速度快、灵敏度高、专一性强,这给诊断和防治禽流感疫情提供了有利的工具。
2．3食品卫生检验
食品营养成分的分析、食品中有毒、有害化学物质的分析、食品中生物毒素(细菌、真菌毒素等)的监督检测工作都可以用生物芯片来完成,一张芯片一次可对水中可能存在常见致病菌进行全面、系统检测与鉴定,且操作简便、快捷。
3．生物芯片在医学中的应用
3．1在疾病诊断中的应用
Wen等人分别用寡核苷酸微阵列P53基因芯片和传统的DNA测序分析法检测77例卵巢癌病人的TP53基因,前者检测出71例病人的TP53基因发生突变,而后者只检出63例,与DNA测序分析87%的准确率比较,寡核苷酸微阵列高达94%。前者敏感度为92%,后者为82%,两
者特异性均为100%,证明生物芯片技术是一种快速有效的检测突变的工具。Elek等人从正常人和3个独立的前列腺癌患者体内提取Mrna,将其反转录成cDNA后制备成含588个基因
的微阵列,并将其用于基因差异表达分析,发现其中至少19个基因在肿瘤及正常组织中差异表达,提示微阵列与相关cDNA库结合,能促进对诊断和治疗前列腺癌及其他肿瘤的潜在靶点的快速鉴定。而Lehman等人使用Affy2metrix公司的P53基因芯片检测了家族性乳腺癌病人P53的突变,发现除了外显子外,在这些患者中还存在P53内含子的突变,而且,是高频率的并伴有功能性活动。在血液病的检测领域还有报道Kurg等人用DNA芯片分析了10例β地中海贫血的基因突变,其中,9个病人的DNA样品中都携带一个不同的突变,而且,还正确鉴定
出4例野生型DNA样品,平均的信噪比是40∶1,这使得突变的高准确性检测成为可能,并且,适用于大面积病人的筛查。
3．2生物芯片在疫苗研制中的应用
意大利的研究人员Grifantini等人利用DNA微阵列技术研究了B群脑膜炎双球菌与人上皮细胞相互作用过程中所发生的基因调控情况,他们发现,在细菌与上皮细胞相互作用中涉及347个基因,其中,30%的基因编码功能还不清楚的蛋白。上调基因包括那些在铁、氯化物、氨基酸、硫酸盐转运过程中涉及的基因、编码众多毒力因子的基因以及含硫氨基酸循环过程中所涉及的基因。有189个上调基因,其中,75个编码表面蛋白,12种蛋白是诱导粘附的表面抗原,5种表面抗原在实验鼠身上可以诱导杀菌抗体,似乎可以成为有效的候选疫苗。由此表明:微阵列技术是鉴定新的候选疫苗的有力策略。Hayward等人利用得自恶性疟原虫绿豆核酸酶基因库的随机插入片段,构建了“鸟枪DNA芯片”,通过示差杂交和克隆测序,发现疟原虫血液期滋养体与有性期配子体之间基因表达差异很大,此项结果大大有助于研制防止疟
原虫传播的阻断剂和设计针对血液期抗原的疫苗。此外,生物芯片技术在药物筛选、遗传药理学、毒理学和病毒感染的快速诊断等领域也有许多成功应用的例子。
四．生物芯片的应用前景
生物芯片技术因其可在一次反应中进行多种信息的平行分析,而受到众多研究者的瞩目,特别是基因芯片在人类基因组计划的研究工作中的应用,不仅极大地促进了该项工作的进行,也使芯片技术在短短的几年间得到了长足的发展,并迅速在杂交测序以外的领域得到广泛的应用,如上所述在基因结构与功能研究上的应用，在食品科学上的应用，在疾病的基因诊断等，但该技术成本高,芯片的制备比较复杂,样品的准备与标记较为繁琐,且其信号检测的灵敏度也有待于进一步提高,这些问题使得该技术的普及与进一步推广存在一定的难度，目前国外正在致力于这些问题的解决与研究,国内也有研究者正在积极地开展该项研究工作，我们有理由相信,随着该技术的不断完善与发展,在将来,无论是基因芯片还是蛋白芯片都会作为一种简便快捷的技术,为我们的研究工作与临床检测带来极大的便利。
