生物芯片技术的发展和展望（一)
丁香园
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生物芯片技术的发展和展望（一）http://www.bioon.com/Article/Class24/Class18/200407/9773.html
作者：令狐 文章来源：中国生命科学论坛 点击数： 更新时间：2004-7-22
不得不承认，生命科学目前还处于技术而非理论推动发展的阶段，一次大的技术革命就会带来一次生命科学的大飞跃。上世纪七十年代的克隆、测序技术推动了人类对基因的初步认识，八十年代出现的PCR及其无数的派生技术则极大的丰富了人类对基因的细节知识。九十年代以来，生命科学有发展而无飞跃，这是为什么！哈哈，因为它在等待下一次技术革命的到来，那就是生物芯片技术。
一、乱谈biochip和microarray
就像大部分生物学术语一样，生物芯片（biochip）的内涵也一直随着时代而与时俱进。Biochip最早出自目前意义上的microarray（微阵列），也就是国内各位最熟知的、二维的、有规律的高密度固定生物分子的实验技术，不过近年以来biochip的涵盖的范围已经很大的变化了。虽然国内至今还有例如“用生物芯片研究。。。。”的文章不断出现，但是大家可以注意到，“生物芯片”的英文对等词“biochip”是很少出现在国外正规的学术论文题目之中的，出现密度比较高的是microarray、LOC、以及array和chip的派生词等，这是因为biochip是这一类实验技术的总称，论文的严肃性当然不会让这个涵盖范围很广甚至其定义都不是很清楚的词随便出现的。
Microarray基本上是指二维的、有规律的高密度固定蛋白、DNA以及细胞等生物分子的东西，也就是国内各位称为“生物芯片”的那些。这个词的概念是比较清楚的，应该好好用，最好不要随便用biochip这个比他大了很多的词去代替。从这种意义上来说，国内诸多“XX生物芯片”公司都是挂羊头卖狗肉的！晕！打到了一片，罪过，罪过！
个人认为，biochip的主要特点是缩微化、集成化和系统化，曾经有段时间macroarray竟然想在国人的心目中混进biochip的团队，还好后劲不足，不然又是误人无数啊！随着biochip的发展，越来越有chip的本色了，biochip与纳米科学、半导体科学、光学结合越来越紧密了，早就不是一张玻璃片就可以代表的角色了。
二、microarry的制备技术
近年来，用于检测大量基因表达的方法有了快速的而且是悄悄的巨大进展。在进步的背后，我们可以可以发现是两种因素推动了这些变化。第一个当然是用户，任何消费者都希望可以使用到物美价廉的商品，对于microarray而言，人们需要可信度、重复性、精确度以及性价比更好的产品。这些产品应该是可以广泛运用于在公众健康监测病原微生物是否存在或者是在治疗和康复过程中的常规的疾病检测、以及象恶性肿瘤预测之类的方面，并且至少能够象目前常用的蛋白检测方法一样提供比较可信的检测结果。
细心的人们可以发现，miroarray技术发展的第二动力来自于那些高技术公司对商业利益的渴望。以Affymertrix为例，这个著名的biochip公司占领了大部分的药厂和研究机构的市场，但是它拥有的专利限制了大部分二维空间内基因表达谱检测设备和技术的使用，实际上已经成为了biochip领域的微软，不过它很可怜，不是吗！至今尚未实现盈利呢！但是，聪明人都可以预见到，这个市场是巨大而且是可以持续发展的，因此利益的驱动促进了人们继续关注于这项技术的发展，因此这些年以来新技术不断的出现，其中某些技术已经超越了Affymertrix目前拥有的技术，但是限于知识产权的保护，这些新技术中的大部分目前还是无法在市场中推广的。
很难列举全部的基因表达谱方面的全部技术，虽然大量的技术在早期的文献中已经有了相关的描述，但是他们还在不断的发展之中，因此对于您如果希望对他们有全面的和最新的了解就必须进行持续的文献跟踪。与其他技术一样，microarry技术也经历了不断发展和完善的过程，其主要类型寡核苷酸芯片和机械点样芯片经过将近5年的发展已经可以达到研究所需要的准确性和重复性的底线。总体上可以看出这些技术的发展是紧密的与科学实验所需要的严谨性相关的。
下面我们将讨论一些主要的和正在发展中的技术。建议大家使用下面的思路考虑分析这些技术。一些用全长的cDNA探针，另外一些使用寡核苷酸探针。除了探针类型的不同之外，这些技术还可能使用二维固相表面或者是液相的三维表面。
这里讨论的每项技术的发展都经历了相同的、当然也是非常必要的路线，就是提高质量、高密度化和更加便宜，这些努力的结果将使科学家、医生或者是普通民众使用到物美价廉的芯片产品。不过这种发展思路必定对微阵列所涉及的所有设备和配件的选择提高很大的难度。当然，生产商推出它的新一代技术的时候，也给同时给用户带来了选购恐慌，microrray不是普通消费品，用户不得不反复考虑新产品与他们使用的老产品之间数据的通用性。并且，目前的微阵列实验系统还是非常昂贵的，即使是耗材也是如此。
下面我们将讨论一些已经可以使用的或者是发展中芯片技术平台。
1、利用生物分子的电物理特性进行基因表达检测
大部分生物分子都是天然就带有电荷的，DNA和蛋白分子基本都具有这种特性。当这些生物分子暴露于电场之中时，就会按照物理学的性质向带有相反电荷的一极运动。新的微阵列技术，比如Nanogen公司的系列研究成果中就利用了这种生物分子的物理性质使之可以在微电极biochip中可以实现特异的定位。通过精确的控制某个区域的电极，这种技术可以控制大量待测分子运动到指定的芯片区域。由于这项技术具有高度可控的性质，因此它的检测速度要快于被动式杂交的方法。
以基因表达检测为例，一个带负电荷的cDNA分子可以快速的移动到带有正电荷的电极区域。DNA样本在正电荷区域可以得到很高的浓缩。那些不具备正确分子量或者是电位的DNA分子在严密控制的电极区域是被排斥的。但是所有基本这种构造的芯片都有共同的弱点，就是这些芯片在密度方面比Affymetrix等公司的产品至少低了一个数量级。不过，此类芯片的检测探针的密度目前正处于高速增长之中，而且此类产品的检测速度是个明显的优势，对急于知道检测检测的地方，例如临床检测方面是有独到的好处的。
这个系统可能非常适合于那些对芯片平台的实用性感兴趣的实验室，因为这个平台可以同时适用于基因表达、蛋白质组以及基因型的研究。
图1 Nanogen公司的微电极芯片
2、利用电场原理进行高密度microarray生产
相对于Nanogen公司的微电极芯片利用电场原理加速检测速度而言，CombiMatrix公司的电磁式芯片产品则利用这个原理在array的制作上。
图2 CombiMatrix公司的电磁式microarray产品。
CombiMatrix'核心技术是被修饰后适用于生物学领域的半导体。 这些集成电路包含可以独立寻址的微电极阵列，再结合特殊的液体流动系统，可以使大部分生物分子都可以按照来自于计算机的数字指令而运动。
在受控制的情况下，每个微电极都可以进行独立寻址的，并且是选择性的化学反应。 因此，可以用于进行原位合成复杂的生物分子 ,例如寡核苷酸等。 这些分子在专有的多孔反应层 (PRL) 里面被综合那一件外套薄片。在软件的控制之下，CombiMatrix chip可以快速平行地数千个不同分子。 相对于常规方法而言，这种技术可以大幅减少实验费用和时间。
图3 一个包含 16个电极(红色的表示那些正在活动的)的半导体表面。依照需要合成的的分子结构，控制软件平行的激活一系列微电极，从而逐步合成所需要的大分子。一个电极一旦激活就会有相应的化学试剂运输到它的位置以进行合成反应。
图4 适合于合成生物分子的半导体表面层（Porous Reaction Layer ，PRL）也是他们的专利技术
相对于Affymetrix那种复杂的原位合成技术而言，CombiMatrix公司的技术到底有多少进步还是各位自己想想吧！只要你调节软件的设置，那么每次在同样的生产条件和成本下，你都可以得到不同的产品，对于那些渴望不断修正自己所用的microarray的实验室而言意义是巨大的。
图5 实验结果展示
3、喷墨点样技术
Agilent公司的微阵列生产工艺建立在历史悠久并且性能卓越的喷墨打印分配系统上。这是一项属于Rosetta Inpharmatics（kirkland，WA）的专利技术，它以高度定位的形式把合成好的寡核苷酸分子喷点在玻璃表面。也就是核酸分子被打印头分别的以喷雾的形式定位到玻璃表面，然后在进行原位结合。目前，这项技术可以一次“打印”25000个点到玻璃基片的表面，并且仅仅使用皮升级的样品。因为使用长的核酸分子进行点样，因此是典型的一点一基因的方式。这一点与Affymetrix的芯片产品是不同的，Affymetrix的使用的是短的以及个别是低特异性的寡核苷酸探针。
从理论上说，非接触式的点样过程与机械的针式点样相比可以提高产品的点样密度。因为合成技术可以得到长达60个硷基的寡核苷酸探针，同样，从理论上说这种技术中使用的探针比Affymetrix使用的短探针具有更好的特异性，并且在GC含量的校正以及非特异性杂交方面也优于长的cDNA分子。这项技术的特性允许对芯片成品进行快速的设计和质量测试。虽然现在还不知道Agilent公司是否会对这项技术提出专利要求，不过这项技术与其他类似的技术相比无疑是生产更加便宜的微阵列产品的高质量技术平台。
4、寡核苷酸包被的微珠芯片（Illumina公司）
Illumina公司的技术是使用独立光学包寡核苷酸的微球。这些微球然后被束缚在光纤束中的独立光纤尖端，而每个光纤束中包括大约2000个独立的光纤尖端。这样每个光纤束中可以固定大约2000个不同的基因，但是其潜在的能力是每个光纤束可以固定50，000到500，000个微球，也就是说每个光纤束可以排列等数的基因或者是其他类型的探针。另外，每个阵列可以包括96到1536个光纤束。可以通过他们自己的专利激光捕获技术对每个微球进行信号检测。这个技术在早期的测试过程中表现非常良好，不过还需要更多的独立实验来证明它的重复性和精确性。
这项技术它潜在的海量探针检测能力，无疑可以显著的拓展我们的研究基因表达谱的范围。例如，数百万的探针已经可以使我们检测人类基因组中的每一个基因的表达，甚至可以包括多聚体以及可变的剪切产物。
图6 Illumina公司的Sentrix Array Matrix和玻璃珠芯片。
芯片的表面拥有数千个包含不同类型微珠的小室 微珠和小室的对应关系是可以控制的 微珠的表面固定有生物探针分子
图7 结构说明
图 8 应用范围
图 9 信号检测原理
图 10 微珠表面结构示意图
TYPICAL PERFORMANCE
Limit of Detection (LOD) at 95% confidence 0.15pM
Precision < 1.3-fold
Dynamic Range (for twofold detection) 2.8 logs
Specificity < 1:250K
Array-to-Array Variation (CV) 10%
Starting Input Requirements 50-200ng total RNA
表 1 进行基因表达检测的技术指标
5、平行信号测序技术：Lynx
Lynx therapeutics公司建立了两种检测基因表达的技术，一种是无需进行凝胶电泳的测序技术，另一种是在微球表面快速克隆数百万计模板的技术。
cDNA模板首先被连接到含有32 mer寡核苷酸尾巴的载体。随机的取1％这些连接好的载体，这样这些模板都是连接到一个唯一的寡核苷酸尾巴的并且每个模板至少会出现一次。这个子集然后进行PCR扩增生成单链，然后与含有与32 mer寡核苷酸尾巴互补序列的微球进行杂交。 这些微球然后被放置到一个流动的小室里。测序反应通过针对四硷基对的核酸内切酶在微球表面直接进行，序列可以通过以次确定荧光标记的探针完成。
因为在这种技术中模板可以直接从mRNA产生，因此它可以有效的用于平行检测大量基因的表达标志序列。因为在这个方法中每个mRNA的单个拷贝都被不同的尾巴标记，而且每个拷贝也是独立测序的，所以这个系统不但可以作定量的分析，而且对低拷贝的基因表达的敏感度也更高，类似于SAGE。这项技术目前已经实现了商品化。
Lynx公司这种产品无疑为科学家提供了一种以另类方式检测海量基因表达的技术，并且真正实现了当初发展biochip技术的初衷－核酸测序。由于这种技术本身很复杂，我没有办法把细节说清楚，还是请各位自己去看看相关资料吧。
图11 Lynx therapeutics公司芯片产品中的微球。
二、Lab on a chip（LOC）进展概述<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />
在biochip技术的发展中，有几个倾向值得注意：自动化、微型化、多样化和价格下降将迅速将芯片工艺推向市场。通过初步应用，人们将对biochip究竟能做什么，不能做什么会有更深入的了解。使芯片设计更实用化、有效化。微缩LOC（Lab on a chip）就是其中最有发展前途的一种。
LOC发展的最终目标是把从样品制备，化学反应到物理检测的整个分析过程集成化，以获得所谓的微型全分析系统或称缩微LOC。
LOC是biochip中最理想的一种。在生命科学和医学研究中，对样品的分析通常包括三个典型步骤即：样品分离处理，生物化学反应，结果检测和分析。LOC正是通过专门的样品制备芯片、反应芯片、检测芯片以及微泵和微阀门等器件，将以上三个步骤连续化、集成化，得到一个封闭式、全功能、微型化的便携式实验室。例如，用于样品制备的有DNA微电泳芯片、细胞成分过滤分离芯片等，用于生化反应的有PCR芯片等。LOC在制造方面应用了微电子技术、纳米技术和半导体技术中的一些加工工艺。采用微加工技术的优点之一是能实现制造工艺的可靠性，同时也降低了生产成本。相信不久将会出现用过即弃的一次性LOC。
这种便携式微型仪器的出现将会大大方便了诸如快速临床医疗诊断和现场农业动植物病害测试应用中的DNA和蛋白之类的分析。和传统的技术相比它不仅有着众多优越之处，而且代表着未来实验室技术的发展的趋势。
LOC主要有如下的优点：
（1）能耗低、物耗少、污染小
因为是在芯片上进行反应，其设备是相当小的，从而使其能源消耗和原料消耗都降低到很低的水平。同时，所需要的反应物是通常的百万分一，从而使要处理的化学废物极少。也就是说，大大降低了污染。
（2）更可靠，更廉价，更快捷
因为LOC没有可以移动的装置，其性能有着很好的连续性，从而使试验结果更可靠和更精确。在许多化学过程中，包括层析和混合，由于受到扩散的限制，样品的扩散距离和它所需的时间，两者之间是非线性的关系，即随着尺寸的减少，扩散过程将会更快、更有效地完成，实验过程也会更快结束。随着技术上的成熟，LOC将会越来越廉价。
（3）安全性
微反应的可控性要比常规方法好得多，因而不太可能出现危险的局面。微化学反应中由于传质和传热的过程很快，这就可以在任意时刻对系统的反应速率和反应物的数量进行控制。所以任何能够产生不稳定产物或大量放热的合成反应通常都可以在芯片上非常安全地进行。
（4）从研究到生产无需费时费力的中式放大过程。
任何关于微反应器优点的讨论都不可避免地要提到化学品的大量生产。微反应器不需要进行工业放大，甚至可以说它们本身已经通过了工业放大。当每个单元的反应条件达到最优化后，则多个单元就会被“平行”放大。例如，为了使产量增至三倍，我们已不需要把反应通道的宽度增至原来的三倍，而只需要将三个原始尺寸相连接。采用这样的方法，我们无须对反应工艺进行再设计或验证。
三、与microarray相关的信息分析软件的发展<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />
任何针对于高通量功能基因组的研究都必然需要配备所有可以利用的分析手段和工具。但是目前看来，即使那些拥有数套生物信息学软件包的大型实验室还是不得不把可以个性化的商业软件进行整合才可以满足自己的需求。
为了满足分析系统的需要，两个主要类别的功能是必备的，一是数据共享环境，另一个是功能强大的分析工具。前者将允许一个研究团队共享象微阵列实验数据库、相关的说明数据、文献、相关的实验流程等通用的资料，后者可以从基因组数据库中获得临床或者是生物学的知识。
一个功能强大的数据共享或者是公用软件包可以建立一个完善的芯片数据模型，在这个数据模型中包含了所有可以利用和收集到的检测数据，哪怕这些数据是从不同微阵列实验平台中得到的。类似的，公用软件也应该拥有一个非常细致并且可以灵活处理描述性资料的数据模型，在这个数据模型是应该是支持某种可以描述表型（例如病人的年龄、性别、临床病理发展、愈后情况等）和基因型相关性的控制语法的，这种相关性的描述是功能基因组研究过程中必不可少的成分。
在第二类也就是生物信息学软件应该包括可以进行微阵列数据处理和数据挖掘，例如表达倍性分析、自组织作图分析、系统作图分析、SVM分析、进化树分析、k-means聚类分析等，在最佳的情况下，软件应该支持研究者修改算法参数甚至于可以灵活的自己设置统计算法。这些软件同时也应该可以提供分析结果的图形化方法，以及生成可以用于发表的结果、注释，甚至应该包括与相关生物学数据库的链接。
近年来，这个领域的软件明显的分化成上述的两种类别。而且一个很好的现象是这些软件正朝着模块化的发展，这种方向对数据共享、新算法的开发等等研究活动的巨大好处是勿庸置疑的。不过至少到目前为止还没有全能的软件出现，也就是说在那些分析软件包中提供的数据库共享软件的功能都是有限的。
作者：令狐 文章来源：中国生命科学论坛 点击数： 更新时间：2004-7-22
不得不承认，生命科学目前还处于技术而非理论推动发展的阶段，一次大的技术革命就会带来一次生命科学的大飞跃。上世纪七十年代的克隆、测序技术推动了人类对基因的初步认识，八十年代出现的PCR及其无数的派生技术则极大的丰富了人类对基因的细节知识。九十年代以来，生命科学有发展而无飞跃，这是为什么！哈哈，因为它在等待下一次技术革命的到来，那就是生物芯片技术。
一、乱谈biochip和microarray
就像大部分生物学术语一样，生物芯片（biochip）的内涵也一直随着时代而与时俱进。Biochip最早出自目前意义上的microarray（微阵列），也就是国内各位最熟知的、二维的、有规律的高密度固定生物分子的实验技术，不过近年以来biochip的涵盖的范围已经很大的变化了。虽然国内至今还有例如“用生物芯片研究。。。。”的文章不断出现，但是大家可以注意到，“生物芯片”的英文对等词“biochip”是很少出现在国外正规的学术论文题目之中的，出现密度比较高的是microarray、LOC、以及array和chip的派生词等，这是因为biochip是这一类实验技术的总称，论文的严肃性当然不会让这个涵盖范围很广甚至其定义都不是很清楚的词随便出现的。
Microarray基本上是指二维的、有规律的高密度固定蛋白、DNA以及细胞等生物分子的东西，也就是国内各位称为“生物芯片”的那些。这个词的概念是比较清楚的，应该好好用，最好不要随便用biochip这个比他大了很多的词去代替。从这种意义上来说，国内诸多“XX生物芯片”公司都是挂羊头卖狗肉的！晕！打到了一片，罪过，罪过！
个人认为，biochip的主要特点是缩微化、集成化和系统化，曾经有段时间macroarray竟然想在国人的心目中混进biochip的团队，还好后劲不足，不然又是误人无数啊！随着biochip的发展，越来越有chip的本色了，biochip与纳米科学、半导体科学、光学结合越来越紧密了，早就不是一张玻璃片就可以代表的角色了。
二、microarry的制备技术
近年来，用于检测大量基因表达的方法有了快速的而且是悄悄的巨大进展。在进步的背后，我们可以可以发现是两种因素推动了这些变化。第一个当然是用户，任何消费者都希望可以使用到物美价廉的商品，对于microarray而言，人们需要可信度、重复性、精确度以及性价比更好的产品。这些产品应该是可以广泛运用于在公众健康监测病原微生物是否存在或者是在治疗和康复过程中的常规的疾病检测、以及象恶性肿瘤预测之类的方面，并且至少能够象目前常用的蛋白检测方法一样提供比较可信的检测结果。
细心的人们可以发现，miroarray技术发展的第二动力来自于那些高技术公司对商业利益的渴望。以Affymertrix为例，这个著名的biochip公司占领了大部分的药厂和研究机构的市场，但是它拥有的专利限制了大部分二维空间内基因表达谱检测设备和技术的使用，实际上已经成为了biochip领域的微软，不过它很可怜，不是吗！至今尚未实现盈利呢！但是，聪明人都可以预见到，这个市场是巨大而且是可以持续发展的，因此利益的驱动促进了人们继续关注于这项技术的发展，因此这些年以来新技术不断的出现，其中某些技术已经超越了Affymertrix目前拥有的技术，但是限于知识产权的保护，这些新技术中的大部分目前还是无法在市场中推广的。
很难列举全部的基因表达谱方面的全部技术，虽然大量的技术在早期的文献中已经有了相关的描述，但是他们还在不断的发展之中，因此对于您如果希望对他们有全面的和最新的了解就必须进行持续的文献跟踪。与其他技术一样，microarry技术也经历了不断发展和完善的过程，其主要类型寡核苷酸芯片和机械点样芯片经过将近5年的发展已经可以达到研究所需要的准确性和重复性的底线。总体上可以看出这些技术的发展是紧密的与科学实验所需要的严谨性相关的。
下面我们将讨论一些主要的和正在发展中的技术。建议大家使用下面的思路考虑分析这些技术。一些用全长的cDNA探针，另外一些使用寡核苷酸探针。除了探针类型的不同之外，这些技术还可能使用二维固相表面或者是液相的三维表面。
这里讨论的每项技术的发展都经历了相同的、当然也是非常必要的路线，就是提高质量、高密度化和更加便宜，这些努力的结果将使科学家、医生或者是普通民众使用到物美价廉的芯片产品。不过这种发展思路必定对微阵列所涉及的所有设备和配件的选择提高很大的难度。当然，生产商推出它的新一代技术的时候，也给同时给用户带来了选购恐慌，microrray不是普通消费品，用户不得不反复考虑新产品与他们使用的老产品之间数据的通用性。并且，目前的微阵列实验系统还是非常昂贵的，即使是耗材也是如此。
下面我们将讨论一些已经可以使用的或者是发展中芯片技术平台。
1、利用生物分子的电物理特性进行基因表达检测
大部分生物分子都是天然就带有电荷的，DNA和蛋白分子基本都具有这种特性。当这些生物分子暴露于电场之中时，就会按照物理学的性质向带有相反电荷的一极运动。新的微阵列技术，比如Nanogen公司的系列研究成果中就利用了这种生物分子的物理性质使之可以在微电极biochip中可以实现特异的定位。通过精确的控制某个区域的电极，这种技术可以控制大量待测分子运动到指定的芯片区域。由于这项技术具有高度可控的性质，因此它的检测速度要快于被动式杂交的方法。
以基因表达检测为例，一个带负电荷的cDNA分子可以快速的移动到带有正电荷的电极区域。DNA样本在正电荷区域可以得到很高的浓缩。那些不具备正确分子量或者是电位的DNA分子在严密控制的电极区域是被排斥的。但是所有基本这种构造的芯片都有共同的弱点，就是这些芯片在密度方面比Affymetrix等公司的产品至少低了一个数量级。不过，此类芯片的检测探针的密度目前正处于高速增长之中，而且此类产品的检测速度是个明显的优势，对急于知道检测检测的地方，例如临床检测方面是有独到的好处的。
这个系统可能非常适合于那些对芯片平台的实用性感兴趣的实验室，因为这个平台可以同时适用于基因表达、蛋白质组以及基因型的研究。
图1 Nanogen公司的微电极芯片
2、利用电场原理进行高密度microarray生产
相对于Nanogen公司的微电极芯片利用电场原理加速检测速度而言，CombiMatrix公司的电磁式芯片产品则利用这个原理在array的制作上。
图2 CombiMatrix公司的电磁式microarray产品。
CombiMatrix'核心技术是被修饰后适用于生物学领域的半导体。 这些集成电路包含可以独立寻址的微电极阵列，再结合特殊的液体流动系统，可以使大部分生物分子都可以按照来自于计算机的数字指令而运动。
在受控制的情况下，每个微电极都可以进行独立寻址的，并且是选择性的化学反应。 因此，可以用于进行原位合成复杂的生物分子 ,例如寡核苷酸等。 这些分子在专有的多孔反应层 (PRL) 里面被综合那一件外套薄片。在软件的控制之下，CombiMatrix chip可以快速平行地数千个不同分子。 相对于常规方法而言，这种技术可以大幅减少实验费用和时间。
图3 一个包含 16个电极(红色的表示那些正在活动的)的半导体表面。依照需要合成的的分子结构，控制软件平行的激活一系列微电极，从而逐步合成所需要的大分子。一个电极一旦激活就会有相应的化学试剂运输到它的位置以进行合成反应。
图4 适合于合成生物分子的半导体表面层（Porous Reaction Layer ，PRL）也是他们的专利技术
相对于Affymetrix那种复杂的原位合成技术而言，CombiMatrix公司的技术到底有多少进步还是各位自己想想吧！只要你调节软件的设置，那么每次在同样的生产条件和成本下，你都可以得到不同的产品，对于那些渴望不断修正自己所用的microarray的实验室而言意义是巨大的。
图5 实验结果展示
3、喷墨点样技术
Agilent公司的微阵列生产工艺建立在历史悠久并且性能卓越的喷墨打印分配系统上。这是一项属于Rosetta Inpharmatics（kirkland，WA）的专利技术，它以高度定位的形式把合成好的寡核苷酸分子喷点在玻璃表面。也就是核酸分子被打印头分别的以喷雾的形式定位到玻璃表面，然后在进行原位结合。目前，这项技术可以一次“打印”25000个点到玻璃基片的表面，并且仅仅使用皮升级的样品。因为使用长的核酸分子进行点样，因此是典型的一点一基因的方式。这一点与Affymetrix的芯片产品是不同的，Affymetrix的使用的是短的以及个别是低特异性的寡核苷酸探针。
从理论上说，非接触式的点样过程与机械的针式点样相比可以提高产品的点样密度。因为合成技术可以得到长达60个硷基的寡核苷酸探针，同样，从理论上说这种技术中使用的探针比Affymetrix使用的短探针具有更好的特异性，并且在GC含量的校正以及非特异性杂交方面也优于长的cDNA分子。这项技术的特性允许对芯片成品进行快速的设计和质量测试。虽然现在还不知道Agilent公司是否会对这项技术提出专利要求，不过这项技术与其他类似的技术相比无疑是生产更加便宜的微阵列产品的高质量技术平台。
4、寡核苷酸包被的微珠芯片（Illumina公司）
Illumina公司的技术是使用独立光学包寡核苷酸的微球。这些微球然后被束缚在光纤束中的独立光纤尖端，而每个光纤束中包括大约2000个独立的光纤尖端。这样每个光纤束中可以固定大约2000个不同的基因，但是其潜在的能力是每个光纤束可以固定50，000到500，000个微球，也就是说每个光纤束可以排列等数的基因或者是其他类型的探针。另外，每个阵列可以包括96到1536个光纤束。可以通过他们自己的专利激光捕获技术对每个微球进行信号检测。这个技术在早期的测试过程中表现非常良好，不过还需要更多的独立实验来证明它的重复性和精确性。
这项技术它潜在的海量探针检测能力，无疑可以显著的拓展我们的研究基因表达谱的范围。例如，数百万的探针已经可以使我们检测人类基因组中的每一个基因的表达，甚至可以包括多聚体以及可变的剪切产物。
图6 Illumina公司的Sentrix Array Matrix和玻璃珠芯片。
芯片的表面拥有数千个包含不同类型微珠的小室 微珠和小室的对应关系是可以控制的 微珠的表面固定有生物探针分子
图7 结构说明
图 8 应用范围
图 9 信号检测原理
图 10 微珠表面结构示意图
TYPICAL PERFORMANCE
Limit of Detection (LOD) at 95% confidence 0.15pM
Precision < 1.3-fold
Dynamic Range (for twofold detection) 2.8 logs
Specificity < 1:250K
Array-to-Array Variation (CV) 10%
Starting Input Requirements 50-200ng total RNA
表 1 进行基因表达检测的技术指标
5、平行信号测序技术：Lynx
Lynx therapeutics公司建立了两种检测基因表达的技术，一种是无需进行凝胶电泳的测序技术，另一种是在微球表面快速克隆数百万计模板的技术。
cDNA模板首先被连接到含有32 mer寡核苷酸尾巴的载体。随机的取1％这些连接好的载体，这样这些模板都是连接到一个唯一的寡核苷酸尾巴的并且每个模板至少会出现一次。这个子集然后进行PCR扩增生成单链，然后与含有与32 mer寡核苷酸尾巴互补序列的微球进行杂交。 这些微球然后被放置到一个流动的小室里。测序反应通过针对四硷基对的核酸内切酶在微球表面直接进行，序列可以通过以次确定荧光标记的探针完成。
因为在这种技术中模板可以直接从mRNA产生，因此它可以有效的用于平行检测大量基因的表达标志序列。因为在这个方法中每个mRNA的单个拷贝都被不同的尾巴标记，而且每个拷贝也是独立测序的，所以这个系统不但可以作定量的分析，而且对低拷贝的基因表达的敏感度也更高，类似于SAGE。这项技术目前已经实现了商品化。
Lynx公司这种产品无疑为科学家提供了一种以另类方式检测海量基因表达的技术，并且真正实现了当初发展biochip技术的初衷－核酸测序。由于这种技术本身很复杂，我没有办法把细节说清楚，还是请各位自己去看看相关资料吧。
图11 Lynx therapeutics公司芯片产品中的微球。
二、Lab on a chip（LOC）进展概述<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />
在biochip技术的发展中，有几个倾向值得注意：自动化、微型化、多样化和价格下降将迅速将芯片工艺推向市场。通过初步应用，人们将对biochip究竟能做什么，不能做什么会有更深入的了解。使芯片设计更实用化、有效化。微缩LOC（Lab on a chip）就是其中最有发展前途的一种。
LOC发展的最终目标是把从样品制备，化学反应到物理检测的整个分析过程集成化，以获得所谓的微型全分析系统或称缩微LOC。
LOC是biochip中最理想的一种。在生命科学和医学研究中，对样品的分析通常包括三个典型步骤即：样品分离处理，生物化学反应，结果检测和分析。LOC正是通过专门的样品制备芯片、反应芯片、检测芯片以及微泵和微阀门等器件，将以上三个步骤连续化、集成化，得到一个封闭式、全功能、微型化的便携式实验室。例如，用于样品制备的有DNA微电泳芯片、细胞成分过滤分离芯片等，用于生化反应的有PCR芯片等。LOC在制造方面应用了微电子技术、纳米技术和半导体技术中的一些加工工艺。采用微加工技术的优点之一是能实现制造工艺的可靠性，同时也降低了生产成本。相信不久将会出现用过即弃的一次性LOC。
这种便携式微型仪器的出现将会大大方便了诸如快速临床医疗诊断和现场农业动植物病害测试应用中的DNA和蛋白之类的分析。和传统的技术相比它不仅有着众多优越之处，而且代表着未来实验室技术的发展的趋势。
LOC主要有如下的优点：
（1）能耗低、物耗少、污染小
因为是在芯片上进行反应，其设备是相当小的，从而使其能源消耗和原料消耗都降低到很低的水平。同时，所需要的反应物是通常的百万分一，从而使要处理的化学废物极少。也就是说，大大降低了污染。
（2）更可靠，更廉价，更快捷
因为LOC没有可以移动的装置，其性能有着很好的连续性，从而使试验结果更可靠和更精确。在许多化学过程中，包括层析和混合，由于受到扩散的限制，样品的扩散距离和它所需的时间，两者之间是非线性的关系，即随着尺寸的减少，扩散过程将会更快、更有效地完成，实验过程也会更快结束。随着技术上的成熟，LOC将会越来越廉价。
（3）安全性
微反应的可控性要比常规方法好得多，因而不太可能出现危险的局面。微化学反应中由于传质和传热的过程很快，这就可以在任意时刻对系统的反应速率和反应物的数量进行控制。所以任何能够产生不稳定产物或大量放热的合成反应通常都可以在芯片上非常安全地进行。
（4）从研究到生产无需费时费力的中式放大过程。
任何关于微反应器优点的讨论都不可避免地要提到化学品的大量生产。微反应器不需要进行工业放大，甚至可以说它们本身已经通过了工业放大。当每个单元的反应条件达到最优化后，则多个单元就会被“平行”放大。例如，为了使产量增至三倍，我们已不需要把反应通道的宽度增至原来的三倍，而只需要将三个原始尺寸相连接。采用这样的方法，我们无须对反应工艺进行再设计或验证。
三、与microarray相关的信息分析软件的发展<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />
任何针对于高通量功能基因组的研究都必然需要配备所有可以利用的分析手段和工具。但是目前看来，即使那些拥有数套生物信息学软件包的大型实验室还是不得不把可以个性化的商业软件进行整合才可以满足自己的需求。
为了满足分析系统的需要，两个主要类别的功能是必备的，一是数据共享环境，另一个是功能强大的分析工具。前者将允许一个研究团队共享象微阵列实验数据库、相关的说明数据、文献、相关的实验流程等通用的资料，后者可以从基因组数据库中获得临床或者是生物学的知识。
一个功能强大的数据共享或者是公用软件包可以建立一个完善的芯片数据模型，在这个数据模型中包含了所有可以利用和收集到的检测数据，哪怕这些数据是从不同微阵列实验平台中得到的。类似的，公用软件也应该拥有一个非常细致并且可以灵活处理描述性资料的数据模型，在这个数据模型是应该是支持某种可以描述表型（例如病人的年龄、性别、临床病理发展、愈后情况等）和基因型相关性的控制语法的，这种相关性的描述是功能基因组研究过程中必不可少的成分。
在第二类也就是生物信息学软件应该包括可以进行微阵列数据处理和数据挖掘，例如表达倍性分析、自组织作图分析、系统作图分析、SVM分析、进化树分析、k-means聚类分析等，在最佳的情况下，软件应该支持研究者修改算法参数甚至于可以灵活的自己设置统计算法。这些软件同时也应该可以提供分析结果的图形化方法，以及生成可以用于发表的结果、注释，甚至应该包括与相关生物学数据库的链接。
近年来，这个领域的软件明显的分化成上述的两种类别。而且一个很好的现象是这些软件正朝着模块化的发展，这种方向对数据共享、新算法的开发等等研究活动的巨大好处是勿庸置疑的。不过至少到目前为止还没有全能的软件出现，也就是说在那些分析软件包中提供的数据库共享软件的功能都是有限的。
