提取RNA需要在冰上操作吗?

刚才看到一个老兄讲到提高RNA浓度的方法,认为与离心的速度有关,其实不然.本人提的组织RNA的浓度,OD260/280值都在1.8-1.95之间,其中在相分离时上清吸取时不要吸到下一层很重要.本人现贴上TRIZOL说明书的RNA操作步骤,其中本人根据实验室的经验加以补充,供各位参考.

Trizol 法提取RNA实验步骤：

需要的试剂：

氯仿

异丙醇

75%乙醇（in DEPC-treated water)

RNase free水或者0.5% SDS溶液 [准备不含RNase的水，将其装入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC) to 0.01% (v/v)。静置过夜，然后高压灭菌。0.5% SDS溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水]

1、组织匀浆

(1) 取出高温高压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒入液氮，研碎。

(2) 每50-100mg均浆组织标本中加入1ml的TRIZOL，标本的量不能超过TRIZOL体积的10%，否则会出现DNA污染。

(3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。

2、相分离

加入0.2 ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15秒，在15- 30°C放置2-3分钟，然后离心 12,000× g，15 minutes ， 2 - 8°C。离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。RNA只存在于水相中。水相占总TRIZOL的60%。

3、RNA沉淀

将上层水相转移到另一干净的EP管中， 加入0.5ml异丙醇，混匀,静置10 minutes ，15 -30°C，然后离心12,000 × g ，10 minutes， 2 - 8°C。离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。

4、RNA洗涤

去上清， 加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7,500 × g ，5 minutes，2 -8°C。

5、RNA再溶解

去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，（不能在真空中离心干燥）。注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。部份溶解的RNA样品其A260/280 ratio < 1.6。

用无RNase 水或0.5% SDS溶液重悬RNA沉淀，用枪头反复吹打几次，静置10分钟，55-60°C。测浓度后-20°C保存。

6、测浓度

取2μl 储存液加入另一个EP管中，再加入98μl无RNase水，离心混匀，以无RNase水作空白对照，测OD260/280值。1 OD=40μg RNA。OD260/280值在1.8-2.0视为纯度很高。一般浓在1000ng/ml较准。浓度太高要稀释以后再测定。

7、RNA鉴定

甲醛变性琼脂糖电泳，确定抽提RNA完整性和DNA污染情况。

注意事项:

在使用TRIZOL的时候要带手套和眼罩，避免接触到皮肤和衣服，使用化学通风橱，防止蒸汽吸入。

除非特别说明，所有的操作均在15-30°C下进行，所用的试剂均放置于15-30°C。

组织在加入氯仿之前是可以在-60—-70°C放置一个月 。RNA沉淀在75%乙醇中在2-8°C下至少可以放置一周，在–5— -20°C至少可能放置一年。

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