【共享】RNA抽提实验注意事项，以及各种RNA的抽体的常用方法及步骤，还有质量鉴定的几种方法

本人在做RNA抽提实验中总结了一些需要注意的事项，以及一些抽提各种RNA的常用方法及步骤。希望与大家共同分享：

高质量的真核生物mＲＮＡ的提取， 必须使用ＲＮＡ酶的抑制剂或采用下述的破碎细胞和灭活ＲＮＡ酶同步进行的方法，最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的ＲＮＡ酶的活性。同时，避免偶然引入实验室内其他潜在的痕量ＲＮＡ酶也很重要。

下面列举避免ＲＮＡ酶法染问题的一些注意事项。大多数有经验的研究者并不拘泥于这些注意事项，只是在遇到问题时可能采用其中的一种或几种方法加以解决。

（一）实验程序

　　如不谨慎操作，外源性ＲＮＡ酶可以通过下述途径污染ＲＮＡ制品：

（１）玻璃制品、塑料制品和电泳槽

灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无ＲＮＡ酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存ＲＮＡ。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有ＲＮＡ酶法染，使用前必须于180 ℃干烤８小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。

另一种方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）的水溶液浸泡用于制备ＲＮＡ的烧杯，试管和其他用品。ＤＥＰＣ是ＲＮＡ酶的强烈抑制剂，但其作用并不是绝对的（Ｆedorcsak和Ehrenberg,1966）。

灌满ＤＥＰＣ的玻璃或塑料器皿在37℃放置２小时，然后用灭菌水淋洗数次， 并于100℃干烤15分钟（Ｋumar和Ｌindberg,1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌15分钟。上述处理可以除去器甲上痕量的ＤＥＰＣ，以防ＤＥＰＣ通过羧甲基化作用对ＲＮＡ的嘌呤碱基进行修饰。

　　羧甲基化的ＲＮＡ在无细胞体系中翻译效率很低，然而，除非其中大部分嘌呤碱基均被修饰，否则其形成ＤＮＡ：ＲＮＡ或ＲＮＡ：ＲＮＡ杂交体的能力并不明显降低。用于ＲＮＡ电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满３％的Ｈ２Ｏ２溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1 ％ＤＥＰＣ处理水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为ＲＮＡ实验专用。

（２）研究人员造成的污染

ＲＮＡ酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此，在准备分离的和分析ＲＮＡ的材料和溶液时，凡有涉及ＲＮＡ的一切操作过程中，都应戴一次性手套，接触非RNA专用的玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上ＲＮＡ酶，因此进行ＲＮＡ实验时应勤换手套。

（３）污染的溶液

用高压灭菌的水和ＲＮＡ研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无ＲＮＡ酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1％ＤＥＰＣ于37℃至少处理12小时，然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。

注：ＤＥＰＣ可与胺类迅速发生化学反应，因些不能用来处理含有Ｔris 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Ｔris晶体以制备无ＲＮＡ酶的溶液。

（二）ＲＮＡ酶的抑制剂

下面介绍３种广泛应用的特异性ＲＮＡ酶抑制剂。

（１）ＲＮＡ酶的蛋白质抑制剂是 从人胎盘分离的一种蛋白质可与多种ＲＮＡ酶紧密结合（KI≈3x1010）形成非共价结合的等摩尔复合物，使ＲＮＡ酶失活。

此蛋白质体内可能是血管生成素的抑制剂，血管生成素是氨基酸序列和推测的三级结构与胰ＲＮＡ酶类似的一种血管生成因子， 几个厂家以不同的商品名出售这种抑制剂，该蛋白质应置于含５mmol/L二硫苏糖醇（ＤＴＴ）的50％甘油中，贮存于－20℃。

抑制剂制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用，因为上述处理会使蛋白质变性从而释放出所结合的ＲＮＡ酶。因此，在使用变性剂裂解哺乳动物细胞这一提取ＲＮＡ的初始步聚中不应使用这种蛋白抑制剂。

然而职用更温和的裂解方法时应使用这种抑制剂，并且在后续的所有ＲＮＡ纯化步骤中均应有此蛋白质存在。由于酚抽提可以除蛋白质抑制剂，故应在纯化过程中补加几次抑制剂。其最大活性的发挥要求巯基试剂，而且它并不干扰反转录或mＲＮＡ在无细胞体系中的翻译。我们实验室都用这种。

（２）氧钒核糖核苷复合物 这种由氧钒（ＩＶ）离子和４种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物，是量种过渡态类似物，它能与多种ＲＮＡ酶结合并几科能百分之百地抑制ＲＮＡ酶的活性。这４种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中，在ＲＮＡ提取和纯化的所有过程中，其使用浓度都是10mmol/L。

所得到的mＲＮＡ可直接在硅卵母细胞中进行翻译， 并能作为某些外酶促反应（如mＲＮＡ反转录）的模板。然而氧钒核糖核苷复合物强烈抑制mＲＮＡ在无细胞体系中的翻译，因此必须用含0.1 ％羟基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有几家公司出售氧钒核糖核苷复合物。

（３）Ｍacaloid（硅藻上） Ｍacaloid是一咱粘土，很多年前就发现它能吸附ＲＮＡ酶，用缓冲液将其制成浆液，以0.015％（Ｗ/Ｖ）的终浓度溶解细胞。 这种粘土随同它所吸附的ＲＮＡ酶可在后续的ＲＮＡ纯化过程中（如酚抽提后）经离心去除。

(三）破碎细胞和灭活ＲＮＡ酶同步进行的方法

　　用强烈变性如盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质， 导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来。

ＲＮＡ酶可耐受多种处理等，因此可联用上述试剂，从组织中，如富含ＲＮＡ酶的胰腺中，提取完整无损的ＲＮＡ。下述实验程序系列利用ＲＮＡ酶抑制剂和（或）能迅速灭活ＲＮＡ酶的有关方法从组织或细胞培养物中分离总ＲＮＡ、核内ＲＮＡ和胞质内ＲＮＡ。

哺乳动物细胞总ＲＮＡ的分离

　　这一从培养的单层哺乳动物细胞中分离ＲＮＡ的实验程序系为Ｆavaloro 等（1980）所介绍程序的改良。该程序同样适用于从悬浮培养的哺乳动物细胞中或从易于分散成单个细胞的哺乳动物组织中分离ＲＮＡ。

但不适用于从固体组织中提取ＲＮＡ，因为用这种裂解细胞的方法（在ＳＤＳ存在的条件下用蛋白酶Ｋ消化）去消化组织速度很慢，导致内源性ＲＮＡ酶在被蛋白酶Ｋ消化或被抑制剂灭活前有时间发挥作用。

原方案中（Ｆavaloro等。1980）采用的裂解缓冲液含有0.015 ％（W/V）的Ｍacaloid（硅藻土），用于吸附并灭活ＲＮＡ酶。尽管现仍有Ｍacaloid出售ＮＬ Ｃhemicals）， 但氧钒核糖核苷复合物和ＲＮＡ酶的蛋白质抑制剂更常用。下述程序的优点是速度快，并能同时处理很多样品。

一细胞的裂解

a．单层细胞的裂解

a）吸出培养液，以７ml用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲盐溶液ＰＢＳ冲洗细胞培养皿内的单层细胞，重复１次，将平板置于冰上直至所有单层细胞冲洗完毕。也可将平板放在一块铝板上，再将铝板置于冰盘上。

b）直径为90mm的培养皿需加0.5ml ＲＮＡ提取缓冲液， 并使之遍布整个平板的表面

ＲＮＡ提取缓冲注液

0.14mol/L NaCl

1.5mmol/L MgCl₂

10mmol/L Tris.Cl(pH8.6)

0.5％NP-4

1mmol/L二硫苏糖醇（ＤＴＴ）

100单位/ml胎盘ＲＮＡ酶抑制剂或20mmol/L氧钒核糖核苷复合物

c）加0.5ml蛋白酶消化缓冲液，用刮棒混匀粘稠状裂解物并将其刮到平板的边缘。

蛋白酶消化缓冲液

0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0)
25mmol/L EDTA(pH8.0)
0.3mol/L NaCl
2％ SDS

d）用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物，再将其注入聚丙烯管内。重复３－４次，剪切ＤＮＡ。

c）加蛋白酶Ｋ至终浓度为200μg/ml，充分混匀后置于37℃温育30分钟。

蛋白酶Ｋ以贮存液的形式保存，贮存液为20mg/ml 蛋白Ｋ溶液。

b．悬浮培养的细胞或组织单细胞悬液的裂解

a）于４℃以2000g离心５分钟收集细胞，以10倍体积用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲液悬沉淀，洗涤细胞３次，每次均用大口径的吸管轻轻吹打细胞沉淀，使其彻底分散。

b）估计细胞沉淀的体积，用10-20倍体积的ＲＮＡ提取缓冲液重悬之。

c）加入与步骤b）所加ＲＮＡ提取缓冲液体相同的蛋白酶消化缓冲液，用振荡器迅速混匀。用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物，再将其注入聚丙烯管内。重复３－４次，剪切ＤＮＡ。

d）加蛋白酶Ｋ至终浓度为200μg/ml,充分混匀后置于37℃温育30分钟。蛋白酶Ｋ以贮存的形式保存，贮存液为20μg/ml蛋白酶Ｋ水溶液。返回二提取步骤

２）用等体积酚：氯仿抽提１次，以去除蛋白质。

３）用吊桶式转头于室温以5000g离心10分钟使水相与有机相分相， 将水相吸至一个新的离心管内，加2.5倍体积用冰预次序的乙醇，充分混匀， 于０℃放置１小时。

４）于０℃以5000g离心10分钟沉淀ＲＮＡ，弃上清，用含0.1mol/L 乙酸钠（pH5.2）的70％乙酸洗涤沉淀，用自动微量移液器尽可能将乙醇吸尽， 随后于室温放置几分钟，晾干沉淀。切勿抽干沉淀，因为干的核酸沉淀很难溶解。

５）每个直径为90mm的培养皿或每107细胞加200μl 50mmol/L Tris.Cl( pH7.8)１mmol/L EDTA(pH8.0)溶液重溶沉淀。

６）分别按10mmol/L和0.1mmol/L的深度加ＭgＣl2和二硫苏糖醇（ＤＴＴ），然后分别按1000单位/或10mmol/L 的终深度加台盘ＲＮＡ酶抑制剂或氧钒核苷复合物。

７）加入无ＲＮＡ酶的胰ＤＮＡ酶Ｉ至终浓度为２μg/ml，混匀，于37℃温育60分钟。

８）分别按10mmol/L和0.2％的终浓度加ＥＤＴＡ和ＳＤＳ。

９）用等体积酚：氯仿抽提１次。

10）于室温以5000g离心10分钟使水相与有机相分相， 将水相吸至另一个离心管内，加３mol/L乙酸钠（pＨ5.2）至终浓度为0.3mol/L，加2.5倍体积用冰预次的乙醇，充分混匀，冰浴放置２小时。

11）用微量离心机于４℃以12 000g离心５分钟沉淀ＲＮＡ。

12）吸出所有的乙醇，将打开管盖的离心管在实验台放置几分钟，让最后残存的痕量乙醇挥发干净。

13）用200μl ＴＥ（pＨ7.6）重溶沉淀，加500μl乙醇，于－70 ℃贮存备用。回收ＤＮＡ时，只须取出１小份贮存液，加入３mol/L乙酸钠（pＨ5.2 ）至终浓度为0.3mol/L，充分混匀，用微量离心机于４℃以12 000g离心５分钟即可。

三注意事项

１．测定最终所得溶液的ＯＤ260值可以确定ＲＮＡ的浓度。取10μl乙醇/ＴＥ混合液[步骤13）]离心沉淀ＲＮＡ，以400水重溶， 测定ＯＤ260 值， ＯＤ260＝１的ＲＮＡ溶液每毫升约含40μg ＲＮＡ。

2.如果需要，可用oligo(dT) －纤维素层析法从所制备的细胞总ＲＮＡ中纯化无寡脱氧核糖核苷酸污染的mRNA或购买试剂盒进行mRNA的纯化。

３.某些情况下（例如从感染了ＤＮＡ病毒或用ＤＮＡ转染的细胞中制备ＲＮＡ时），必须从细胞总ＲＮＡ中去除寡脱氧核核苷酸。否则，当用这种ＲＮＡ构建cＤＮＡ库或进行引物延伸反应时应会出问题， 反转录过程中法染的模板ＤＮＡ片段可能会与ＲＮＡ杂交而充当引物，从而导致物定mＲＮＡ５'末端定位的错误或产生截短的cＤＮＡ克隆。

a）步骤12后，加200μl 3mol/L乙酸钠（pＨ5.2），用自动微量移液器反复吹吸，以重悬核酸沉淀，将悬浮液移至另一个灭菌的微量离心管内。

b）用微量离心机于室温以12 000g离心10分钟，ＲＮＡ沉于管底，而绝大部分寡脱氧核糖核苷酸仍在上清中。

c）弃上清液，用200μl ＴＥ（pＨ7.6）重溶沉淀。加入20μl 3mol/L乙酸钠（pＨ5.2），分混匀，加入550μl用冰预冷的乙醇。混匀溶液， 在冰上骤冷30分钟。用微量离心机于4℃以12 000g离主10分钟，以回收ＲＮＡ。

小心吸出上清。d）弃上清液，用300μl ＴＥ（pＨ7.6）重溶沉淀，加１ml乙醇，－70℃贮存备用。回收ＲＮＡ时，只需取出１小份贮存液，加３mol乙酸钠（pＨ5.2 ）至终浓度为0.3mol/L充分混匀，用微量离心机于４℃以12 000g离心５分钟即可。如需去除氧钒核糖核苷复合物，用含0.1％羟喹啉的苯酚[用0.01mol/L Tris.Cl(pH7.8)平衡]将ＲＮＡ终溶液抽提数次即可。

4. 对大多数细胞株来说， 一个直径90mm 培养甲中培养的ＲＮＡ收率为100-200μg。

用异硫氰酸胍和有机溶剂提取ＲＮＡ

　　收集细胞，离心5000r/min ，5分钟，弃上清，加入异硫氰酸胍变性液（异硫氰酸胍4mol/L；柠檬酸钠25mmol/L，Sarkosy10.5%,β-巯基乙醇0.1mol/L）500ml，混匀，振荡10秒，加2 mol/L醋酸钠50ml，水饱和酚500m l和氯仿/异戊醇（49：1）100m l颠倒混合数秒钟。

冰浴15分钟，4℃离心10,000 r/min，15分钟，吸取上清，加入等体积异丙醇或2倍体积无水乙醇，4℃离心10,000 r/min，10分钟，弃上清，70%酒精洗涤一次，抽干，加35mlDEPC处理水溶解，取5ml经稀释后紫外测定RNA提取量，其余30ml分装，-20℃保存备用。

mＲＮＡ的分离

　　与rＲＮＡ和tＲＮＡ不同的是，哺乳动物细胞的绝大部分mＲＮＡ在其３'端均有一poly(A)尾，因此可以用oligo(dT)－纤维素亲和层析法从大量的细胞ＲＮＡ中分离mＲＮＡdmonds等，1971;At Ｌeder，1972）。在构建cＤＮＡ文库时， 必须经上述纯化步骤制备mＲＮＡ模板。

进行Ｎorthern杂交或Ｓl 核酸酶作用图分析时，与总ＲＮＡ相比，采用poly(A)+ ＲＮＡ能获得更为满意的结果。 可以按照Ｇilham(1964)所述方法制备Ｏligo(dT)－纤维素，也可以买现成的产品。

１）用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g 0ligo(dT)－纤维素。

２）将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱或装入填有经用ＤＥＰＣ处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴期德吸管中， 柱床体积为0.5-1.0ml,用３倍柱床体积灭菌水冲洗柱床。柱床体积为１m的oligo(dT)－纤维素最大量为10mg总ＲＮＡ，如果总ＲＮＡ的量较少，则应减少oligo(dT)－纤维素的使用量以防止poly(A)+RNA在过柱以及后续步骤中损失。

３）用无菌的１x层析柱加样缓冲液冲洗柱床直至流出液的pH值小于8.0。１x层析柱加样缓冲液

20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)

0.5mol/L NaCl

1mmol/L EDTA(pH8.0)

0.1％SDS

可按以下方法制备灭菌的层析柱加样缓冲液；将适量无ＲＮＡ酶的Ｔris. Cl(pH7.6)、氯化钠和ＥＤＴＡ贮存液（参见344页）混合在15lbf/in2(1.034x105Pa)高压下蒸气灭菌，待其次序却至65℃左右时加入已在65℃预热30分钟的10 ％SDS贮存液。也可以用0.05mol/L柠檬酸钠代替Ｔris.Cl 然后用ＤＥＰＣ处理柠檬钠－NaCL-EDTA和SDS的混合溶液。

４）用灭菌水溶解ＲＮＡ，于65℃温育５分钟后使迅速冷却至室温，加等体积的２x层析柱加样缓冲液，上样，立即用灭菌的试管收集洗液。 当所的ＲＮＡ溶液均进入柱床后，加１倍体积的１x层析柱加样 ，继续收集洗出液。加热ＲＮＡ可以破坏可能涉及poly(A)尾的二级结构。

５）当全部溶液流出后，将收集液置于65℃温育５分钟，重新上样，并收集流出液。

６）用5-10倍柱床体积的１x层析柱加样缓冲液洗柱，分部收集洗出液，测定每一收集管的ＯＤ260。最补由于不带poly)A)的ＲＮＡ洗过柱床， ＯＤ260会很高，后来ＯＤ260值则很小或为零。

在某些方案中，上述步骤后还用５倍柱术体积的含0.1mol/L NaCl的１x 层析柱加样缓冲液洗柱床，然而由于洗出的不带poly(A)的ＲＮＡ很少甚至没有， 因此这一步骤可以省略。

７）用２－３倍柱床体积的经灭菌且无ＲＮＡ酶的洗脱缓冲液洗脱mRNA,以1/3－1/2柱床体积分部收集洗脱液。洗脱缓冲液

10mmol/L Tris.Cl(pH7.6)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
0.05％SDS

用于配制洗脱缓冲液的Tris. Ｃl 和ＥＤＴＡ贮存液应为新近高压的溶液 可用适量的灭菌水稀释上述贮存液配制洗脱缓冲液。洗脱缓冲液不能高压处理，因高压会使溶产生大量气泡。

８）收集液置于透明的小溶器内，测定ＯＤ260， 使用前比色杯须用浓盐酸：甲醇（１：１）浸泡１小时，再用经ＤＥＰＣ处理并高压处理过的水彻底冲洗合并含有ＲＮＡ的洗脱组分。经上述一轮oligo(dT)－纤维素亲和量层析后得到的ＲＮＡ中，带与不带poly(A)的ＲＮＡ，其含量近乎相等。

如欲进一步纯化mRNA,可将洗脱液于65 ℃温育３分钟，迅速冷却至室温，加入ＮaCl至终浓度为0.5mol/L，用同一oligo(dT)纤维素柱进行第二轮层析。

９）收集oligo(dT)－纤维素柱层析的洗脱液，在mRNA溶液中加入３mol/L乙酸钠（pH5.2）至终深度为0.3mol/L并混匀。加2.5 倍体积用冰预冷的乙醇，混匀，冰浴至少30分钟。

10）于４℃以10 000g离心15分钟回收poly(A)+RNA,小心弃去上清液，用70 ％乙醇洗涤沉淀（通常看不见沉淀），离心片刻，在空气中晾干核酸沉淀。

11）用少量水重溶ＲＮＡ，置于比色杯内，测定ＯＤ260， 使用前比色杯须用浓盐酸：甲醇（１：１）浸泡１小时，再用经ＤＥＰＣ处理并高压处理过的水彻底冲洗

12）将mRNA溶液由比色杯移至聚丙烯离心管内，加３倍体积乙醇， 混匀，于－70℃保存备用。回收ＲＮＡ时，只需取出一小份贮存液，加３mol/K乙酸钠（pH5.2）至终浓度为0.3mol/L, 混匀，用微量离心机于４℃以12 000g离心５分钟即可。

病毒RNA提取protocol

1，用异硫氰酸胍提取

提禽流感病毒的详细步骤，可参考（我提过N次做定量PCR都没问题）：

1.取200ul样品数+阴性对照+阳性对照个1.5ml灭菌eppendorf管

2.加600ul异硫氰酸胍，然后加入对照和样品，再加200ul氯仿，颠倒混匀

3.13000rpm离心15min

4.在第3步离心快结束时，另取同样多eppendorf管，加入400ul -20度预冷的异丙醇

5.取第3步离心的上清（一定不要吸取到中间白色层，第3步离心结束往外拿的时候，管子尽量不要倾斜）转移到第4步准备的管中，颠倒混匀

6.13000rpm离心15min，轻轻倒去上清；在吸水纸上尽量沾干液体

7.加600ul 75％乙醇，颠倒数次以洗涤残存异丙醇

7.13000rpm离心15min，轻轻倒去上清；在吸水纸上尽量沾干液体

8.4000rpm离心10sec，将管壁残存液体甩到底部，用微量枪头吸干，室温干燥2－3min（不可过分干燥，防止下一步RNA不溶解）

9.加入20ul DEPE水(加入depc的纯水高压后的水即为DEPE水)，轻轻混匀溶解RNA。2000rpm离心5sec，冰上保存备用（最好2小时内使用，以免RNA降解）

2.用TRIzol LS提取

应用TRIzol LS提取病毒RNA

所提取物为血清、血液、细胞培养液、鸡胚尿囊液等液体中的病毒。提取时尽量在人少时进行，防止空气中RNA酶的污染。所用一切物品也应是无RNA酶的。

1.1 在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul，再加入TRIzol LS 500ul，充分混匀，室温放置10min。

1.2 加入200ul的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象），室温放置10min （由于氯仿沸点低、易挥发，振荡时离心管可能爆开，小心）。

1.3 离心 4℃、13000r/min、15min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。

1.4 加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min。

1.5 离心 4℃、13000r/min、15min，（这时乍一看会发现管子里好像没有东西，再仔细看看，会发现靠近管底的壁上有一星点的白色沉淀物，就是它了）用枪小心吸去所有上清。

1.6 1ml75%乙醇洗一遍，离心 4℃、8000r/min、10min，（这时又会发现管子没东西了，不要担心，有的，但是因为量太少看不见罢了）用枪小心吸去所有上清，在超净台中干燥5min。

1.7 加入适量DEPC处理水。（如果材料来源丰富的话，加入的水量为下一步RT的total减去其他试剂的量；若要省着点用，则自己看着办了，尽量不要加太多的水）。

1.8 建议立即做RT。若要保存，可在上一步加入乙醇后冻存于－70℃，可保存一年；若加入DEPC水后则只能在－20℃保存1个月左右。

3，Trizol法提禽流感病毒protocol

Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。

1、 取鸡胚尿囊液，加入5-10倍体积 Trizol液，混匀；

2、 室温放置5分钟，然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒；

3、 取上层水相于一新的离心管，按每ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟；

4、 弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，混匀，4℃下7500g离心5分钟；

5、 重复第4步；

6、 小心弃去上清液，然后室温干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度；

7、 然后将RNA溶于水中，放置10分钟。

[注意]

1、 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。

2、 加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年

提取完的RNA需要进行质量的鉴定，下面再介绍几种鉴定方法。

1）检测RNA溶液的吸光度

280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。

1.82.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。

当R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。

2）RNA的电泳图谱

一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的，但是根据我的经验，如果你仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。

电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好。

以上是我们常用的两种方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我们很难察觉，但是大部分后续的酶学反应都是在37度以上并且是长时间进行的。

这样，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了，当然这时你的实验也就完了。

下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。

3）保温试验

方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。

时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。

相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染

4）还有一种非常好的方法，我们实验室采用Agilent2100生物分析仪来鉴定RNA样品，其优点在于鉴定速度快，一次可以最多鉴定12个样品，所需样品少，通过结果中的两个峰值（真核生物为18s与28s的比值来判断样品是否降解），软件还给出一个模拟的电泳图（非常漂亮）。