免疫荧光细胞化学染色，你会做吗？

免疫荧光细胞化学染色方法

一、标本制作

可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片，经适当固定或不固定，作免疫荧光染色用。

二、荧光抗体染色方法

（一）直接法

1．染色 切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如 1：8 或 1：16 的荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体或兔抗人 IgG 或 IgA 荧光抗体等），在室温或 37℃ 染色 30 min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。

2．洗片 倾去存留的荧光抗体，将切片浸入 pH7.4 或 pH7.2PBS 中洗两次，搅拌，每次 5 min，再用蒸馏水洗 1 min，除去盐结晶。

3．用 50% 缓冲（0.5mol/L 碳酸盐缓冲液 pH9.0～9.5）甘油封固、镜检

4．对照染色

①正常免荧光血清染色，如上法处理切片，结果应为阴性。

②染色抑制试验（一步法）：将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法处理切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可用盐水代替未标记抗血清，染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。

③类属抗原染色试验，前面已作叙述。

直接法比较简单，适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原，特异性高而敏感性较低。

（二）间接法

（1）切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃ 作用 30 min。然后用 0.01mol/l pH7.2PBS 洗两次，10 min，用吸水吸去或吹干余留的液体。

（2）再滴加间接荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等），同上步骤，染色 30 min，37℃，缓冲盐水洗两次 10 min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。

对照染色：①抗体对照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。②抗原对照：即类属抗原染色，亦应为阴性。③阳性对照。

间接法中上述方法称双层法（Double Layer Method）。另一种称夹心法，即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在，方法步骤如下：

①切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。

②滴加未标记的特异性抗原作用切片于 37℃，30 min。

③缓冲盐水洗 2 次，每次 5 min，吹干。

④滴加特异性荧光抗体再用切片于 37℃，30 min。

⑤如③水洗。

⑥缓冲甘油封固，镜检。

间接法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原，敏感性较高，操作方法较易掌握，而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹）等的研究和检查，所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。

（三）补体法

1．材料

（1）免疫血清 60℃ 灭活 20 min，用 Kolmers 盐水作 2 倍稀释成 1：2，1：4，1：8……。补体用 1：10 稀释的新鲜豚鼠血清，抗补体荧光抗体等，按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价，如为 1：32 则免疫血清应作 1：8 稀释。

（2）补体用新鲜豚鼠血清一般作 1：10 稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果，按 2 单位的比例，用 Kolmers 盐水稀释备用。Kolmers 盐水配法：即在 pH7.4、0.1mol/L 的磷酸缓冲盐水中，溶解 MgSO4 的含量为 0.01% 浓度。

（3）抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为 1：4，补体为 2 单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价 1：4 的浓度用 Kolmers 盐水稀释备用。

2．方法步骤

（1）涂片或切片固定。

（2）吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液（此时免疫血清及补体又都稀释一倍）滴于切片上，37℃ 作用 30 min，置于保持一定湿度的染色盒内。

（3）用缓冲盐水洗 2 次，搅拌，每次 5 min，吸干标本周围水液。

（4）滴加经过适当稀释之抗补体荧光抗体 30 min，37℃，水洗同（3）。

（5）蒸馏水洗 1 min，缓冲甘油封固。

3．对照染色

（1）抗原对照。

（2）抗血清对照：用正常兔血清代替免疫血清。

（3）灭活补体对照：将补体经 56℃30 min 处理后，按补体同样比例稀释，与免疫血清等量混合后，进行补体法染色。

本法之荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制，因而一种荧光抗体可作更广泛的应用，敏感性亦较间接法高，效价低的免疫血清亦可应用，节　省免疫血清，尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。

（四）抗原荧光抗体染色法

本法应用直接法或间接法的原理和步骤，可对活细胞在试管内进行染色，常用于 T 和 B 细胞、细胞培养物、瘤细胞抗原和受体等的检查和研究，阳性荧光主要在细胞膜上。FACS 即采用此法原理。

（五）双重染色法

在同一标本上有两个抗原需要同时显示（如 A 抗原和 B 抗原），A 抗原的抗体用 FITC 标记，B 抗原的抗体用罗达明标记，可采用以下染色方法：

1．一步法双染色　先将两种标记抗体按适当比例混合（A+B），按直接法进行染色。

2．二步法双染色 先用 RB200 标记的 B 抗体染色，不必洗去，再用 FITC 标记的 A 抗体染色，按间接法进行。

结果：A 抗原阳性荧光呈现绿色，B 抗原阳性呈现桔红色荧光。

（六）荧光抗体再染色法

若切片或其他标本经某种荧光抗体染色后，未获得阳性结果，而又疑有另外的病原体存在时，可用相应的荧光抗体再染色。

有时存档蜡块不能再用以切片，也可用存档的 HE 染色标本，褪去盖片和颜色，再作免疫荧光或其它免疫细胞化学的染色。

三、荧光抗原染色法

某些抗原可以用荧光素标记，制成荧光抗原，标记荧光素的方法与制备荧光抗体方法相同。用荧光抗原可以直接检查细胞或组织内的相应抗体，特异性较好，敏感性较差。染色方法同荧光抗体染色的直接法。由于多数抗原难以提纯或量少不昂贵，一般很少采用此法。