构建多基因敲除动物模型，一切如此简单
邦耀生物
我们实验室在细胞信号转导方面技术非常强，但因为没有动物体内的结果，每次发表的文章档次大打折扣。我的导师因此决定要我构建基因敲除小鼠，来验证一些体外研究结果。
由于我们是一个传统的cellular biochemistry实验室，对基因敲除小鼠技术的了解，仅限于书本知识，实践起来完全不够用。这样的课题对我来说几乎是impossible mission，但哪怕最终只有0.1%的成功概率，我也不想放弃，万一成功了呢？
我们前期研究发现，一个內源多肽的受体家族由A,B,C三个基因组成，在小鼠17号染色体间隔排列形成一个大约跨度为95kb的基因簇。当时导师将我送到一个有构建敲除小鼠经验的实验室进行培训，采用ES细胞打靶的方法构建打靶载体、筛选ES细胞等，这种方法曾获诺贝尔奖。实验伊始，师兄就告诉我，构建敲除小鼠可是大工程，至少耗时2年左右，我方才对这个实验有了一点点时间上的概念。我从构建受体A基因打靶载体开始，采用通常的3Kb+2Kb同源臂的测量，将二号外显子替换成为筛选标记基因。
大家知道，基因组DNA做PCR并不容易，我也是换了N对引物才克隆出两条同源臂，前后折腾了4个月，总算构建好了打靶载体。
接下来是ES细胞筛选，这一步很关键，过程充满艰辛。ES细胞看似好养，但稍不留神就会分化失去部分胚胎干细胞性，导致其不能发育成为生殖细胞，无法将突变传递到子代。如果没有germline transmission，前面所有的工作等于零。
好不容易单克隆筛选成功，PCR又碰了壁。现在一般都采用长片段PCR的方法来筛选克隆，比以前需要同位素做southern杂交轻松了很多。但是，两条引物一条需要设计在筛选标记基因上，另外一条需要设计在同源臂以外的小鼠基因组上，产物长度都超过3kb，没有阳性对照，无法确认是引物设计有问题还是根本没有阳性克隆。
PCR做不出来，筛选的克隆又不忍心随便扔掉，引物换了无数，每天早上就是跑去实验室PCR，多少个痛苦的日日夜夜，阳性条带始终没有如期而至。
整个人都要崩溃了，no pain no gain，我简直是在磨练意志。实验室不成熟的平台体系要建立起来谈何容易，终于明白为什么师兄师姐不愿意接下这个课题，而我真是too young too simple。
后来听说有一种叫做TALEN的核酸酶方法做基因敲除很好用，而且有公司能提供相关技术服务。我想，死马当活马医，试试看吧，网上搜索到了几家这样的公司。
因为不了解，我仔细看了看这些公司的官网介绍，发现其中有一家上海邦耀生物，在国内首次报道了利用TALEN构建基因敲除小鼠的工作，而且相关论文发表在《Nucleic Acids Research》上，就发了封邮件过去，简单说明了我的问题和需求。
他们的回复挺让我意外的，因为他们并不推荐我用TALEN技术，而是介绍了一种新的CRISPR/Cas9技术，如下：
CRISPR/Cas9 是一种高效，低毒且准确靶向的新型转基因系统。CRISPR是从细菌用来抵御病毒侵袭的一种获得性免疫防御机制中开发出来的。利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞的特定基因组位点上进行切割、修饰。操作简便，周期短。CRISPR/Cas9系统能够对小鼠和大鼠基因组特定基因位点进行精确编辑。一般五周左右就能够得到F0的首建鼠（founder），具体工作流程：
郁闷归郁闷，课题还是要继续。随后我联系了邦耀的技术人员，共同深入探讨了我的课题，经过初步实验，他们提出了一个关键问题：
A，B，C三个基因都是一个多肽的受体，基因之间会不会有redundancy？这个问题我们在细胞水平的研究论文投稿时就被问到，我们也证明从信号通路上来看确实三个基因功能是重叠的。
通过序列分析，邦耀的技术人员发现这三个受体基因的物理位置靠得非常近，告知我由于基因连锁的原因，在这么近的情况下，几乎没可能将这三个基因单独敲除的小鼠，通过杂交的方式获得三个基因同时敲除的小鼠。
如果这三个基因功能有redundancy，那么单独敲除其中一个可能无法看到表型。这可真是我以前没想到的，假如单独敲除这三个基因都没有表型，那我岂不是前功尽弃？那么大的投入可能会没有任何回报，我真的着急了。
好在邦耀给出了一个看起来可行的方案：Cas9在两个位点切开形成双链断裂之后，细胞会启动NHEJ的修复方式将断裂的双链DNA连接起来，这样会有一定概率删除两个靶点之间的序列。我的这个小鼠虽然跨度为95Kb，但他们相信设计2个sgRNA，将中间片段整基因组删除应该是可以成功的。经过2个月焦虑不安的等待，我终于等到了好消息：95Kb的片段成功的在F0代小鼠里面删除了，而且同时得到了2只founder。当我拿到测序结果和项目进展报告的时候，我的激动无以言表。他们还提供了小鼠DNA和测序引物给我们自己来验证。现在我只需要静静等待F1代杂合子小鼠的出生，就能将小鼠转移到我们自己的动物房进行实验了。
至此我深感做科研一定要视野开阔，不能“一条道走到黑”，要与时俱进，多看paper多了解新技术，才不会盲目浪费时间与精力，经受不必要的“折磨”。我很想谢谢邦耀公司的技术支持和技术员们，多亏了他们创造性的工作，才解决了我的大难题。不由得想来一句：“构建基因敲除小鼠，so easy，导师再也不用担心我做不出来了！
