不同分子量蛋白质的分离——凝胶柱层析法

目的要求

（1）了解凝胶柱层析的原理及应用。

（2）掌握凝胶柱层析的基本操作技术。

实验原理

凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。

凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。

任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：

Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)

在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。

通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。

但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。

本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过Sephadex G－25层析后达到分离。

试剂 和器材

一、 试剂

0.9％ NaCl；10％ NaHCO3）；95％乙醇。

pH 7.0凝酸缓冲液（20mM磷酸二氢钠：20mM磷酸氢二钠＝31mL：69mL）

二、 材料

血红蛋白溶液（Hb）：取抗凝血（肝素）2mL，离心弃去上层血浆。用0.9％NaCl洗血细胞数次（颠倒混匀，离心，弃去上清液），使离心后上清液几乎无淡黄色为止。于洗净的红细胞中加入5倍体积的蒸馏水摇匀，离心去沉淀（破碎的细胞膜等）即为Hb稀释液备用。

DNP－鱼精蛋白溶液：取鱼精蛋白0.15g溶于10％NaHCO3溶液1.5mL中（此时该蛋白质溶液pH应在8.5～9.0左右）。另取二硝基氟苯0.15g，溶于微热的95％乙醇3mL中，待其充分溶解后立即倾入上述蛋白质溶液中。将此管置于沸水浴中煮沸5分钟，注意防止乙醇沸腾溢出。冷却后加2倍体积的95％乙醇，可见黄色的DNP－鱼精蛋白沉淀。离心（300r/m）5分钟，弃去上清液，沉淀用95％乙醇洗2次，所得沉淀用1mL蒸馏水溶解，即为DNP－鱼精蛋白溶液，备用。