酶活性分析法检定蛋白质

表现出来的酶GUS可以水解其基质衍生物pNPG,所产生的黄色生成物p-nitrophenol,可供活性测定 （Jefferson et al, 1986）；

仪器用具：ELISA光度计 （Dynatech）；微量滴定盘 （microtiter plate, Nunc F96 Maxisorb 442404）

药品试剂：基质溶液 （GUS reaction buffer）：pNPG （p-nitrophenyl β-D-glucuronide, Sigma N-1627） 31.5 mg溶于Buffer A-0 100 mL终止液 （stop buffer）：2.5 M 2-amino-2-methyl propanediol （Sigma A-9754）

方法步骤：

1） 吸取20 μL 的蛋白质样本，小心注入微量滴定盘中，避免气泡产生。

2） 每一样品槽加入200 μL 基质液，混合均匀；可用烧热的接种环去除气泡。

3） 静置约1~2 min,颜色开始加深，然后加入30 μL 终止液。 反应时间的长短，要以样本中的酶活性大小来做调整。因为我们只测定色析法各分划的相对酶活性，因此并不加终止液。

4） 以ELISA 光度计测定波长415 nm 的吸光值。

酶活性单位的测定：

a. 以上步骤，只可测定GUS 活性的相对大小，对色析法所得到的各个分划进行侦测，相当方便，但并非酶绝对活性单位的测定方法。

b. 若要测定酶的绝对活性单位，要使用最适当的酶用量，使酶在反应一段固定的时间后，其生成物的呈色吸光度，落在光度计的可测范围的内；然后计算此段时间内，每分钟所产生的吸光度增加量，转换成生成物的莫耳数，即可求得其真正的活性单位。

c. 因此酶的活性单位定义为：每分钟所能催化生成物的 μmole 数。