Fas抗原的检测

Fas（CD95/APO-1）分子已被证实是一种细胞表面的受体，可与Fas配体（FasL）结合，介导细胞凋亡。本法利用抗－Fas－生物素通过蛋白印迹法、流式细胞分析或免疫组化染色检测Fas/Apo-1分子。

【样本来源】

(1) 单层粘附细胞；

(2) 细胞悬液；

(3) 组织切片细胞提取物。

【材料与试剂】（Roche公司试剂盒）

(1) 鼠抗人－Fas-Biotin；

(2) 封闭缓冲液： 0.1mol/L Tris-HCL， 0.1% BSA（w/v）， 0.1% Tween 20（v/v）

(3) POD封闭液：含0.3% H2 O2 的甲醇液；

(4) 链霉亲和素－POD（10mg/ml）

(5) 链霉亲和素－荧光素（10mg/ml）

(6) DAB底物

【操作方法】

1、蛋白印迹法（western blotting）

(1) 准备标本，并经SDS－PAGE分离；

(2) 将所分离的蛋白转移至PVDF或NC膜；

(3) 用封闭缓冲液封闭非特异性结合位点，室温1小时，轻柔振摇；

(4) 用抗－Fas-Biotin（1mg/ml）在含1％BSA的PBS液中室温孵育1小时，轻柔振摇；

(5) TBST室温洗膜2次，每次10min；

(6) 在链霉亲和素－偶联物即链霉亲和素－POD中孵育；

(7) 在大容量的TBST中洗膜4次，每次15min；

(8) 在DAB中室温孵育5～15min；

(9) 观察结果。

2、流式细胞分析法

(1) 以PBS洗细胞（单层细胞或细胞悬液）；

(2) 在抗－Fas-Biotin（1:20稀释）中孵育细胞；

(3) PBS中洗细胞2次；

(4) 于链霉亲和素－荧光素溶液（10mg/ml）中室温孵育30分钟；

(5) PBS中洗细胞2次；

(6) 在荧光显微镜下观察结果或用PBS稀释细胞后进行流式细胞分析。

3、免疫组化法

(1) 已固定的组织或组织切片于APES－包被的玻片上，37℃干燥过夜；

(2) 将已干燥的切片置于混合二甲苯（xylol）中脱蜡，以梯度乙醇脱水；

(3) 将切片置于柠檬酸缓冲液以最高强度微波处理5x5分钟，冷却至室温；

(4) 将玻片浸入PBS，用PBSA（PBS＋BSA）封闭，室温20分钟；

(5) 如需要，在POD封闭液中封闭内源性POD，室温作用30分钟；

(6) 加入抗－Fas-Biotin溶液（1:20至1：100稀释），37℃孵育30分钟，

(7) PBSA洗玻片三次或浸泡洗涤；

(8) 于链霉亲和素－POD溶液中室温孵育30分钟；

(9) PBS中洗玻片三次

(10) DAB底物反应液中孵育直至呈现清晰可见的颜色；

(11) 苏木素（hemalum）复染，封片，观察结果。

【结果判断】

蛋白印迹法：含有Fas抗原的膜成分呈现棕色条带。