原理
亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，对生物素有非常高的亲和力（结合常数高达1015M-1）。生物素很易与蛋白质（如抗体等）以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原（或抗体）分子的目的。
材料与仪器
生物素化抗体
酶标记的亲和素
酶标记的亲和素
步骤
1. 包被抗体：用0.05 mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液将已知抗体作适当稀释，在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加0.1 ml，于4 ℃过夜（18～24 h）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3 min（简称洗涤，下同）。
2. 加样：加入待检样品（未知抗原）或作适当稀释的标准参考品于反应孔中，同时作空白孔、阴性和阳性孔对照。37 ℃孵育1 h，洗涤。
3. 加B-Ab：已作适当稀释的生物素化抗体（B-Ab），每孔加0.1 ml，37 ℃孵育30～60 min。洗涤。
4. 加A-HRP：已作适当稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素（A-HRP），每孔加0.1 ml，37℃孵育30～45 min。洗涤4次。
5. 底物显色：于上述各反应孔中加入临时配制的TMB（或 OPD）底物应用液0.1 ml，于37 ℃孵育10～30 min。再加2 mol/L H2SO4 0.05 ml以终止反应。
6. 结果判定：目测或在ELISA比色仪上测 OD 值（见ELISA部分）。
2. 加样：加入待检样品（未知抗原）或作适当稀释的标准参考品于反应孔中，同时作空白孔、阴性和阳性孔对照。37 ℃孵育1 h，洗涤。
3. 加B-Ab：已作适当稀释的生物素化抗体（B-Ab），每孔加0.1 ml，37 ℃孵育30～60 min。洗涤。
4. 加A-HRP：已作适当稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素（A-HRP），每孔加0.1 ml，37℃孵育30～45 min。洗涤4次。
5. 底物显色：于上述各反应孔中加入临时配制的TMB（或 OPD）底物应用液0.1 ml，于37 ℃孵育10～30 min。再加2 mol/L H2SO4 0.05 ml以终止反应。
6. 结果判定：目测或在ELISA比色仪上测 OD 值（见ELISA部分）。
来源：丁香实验
