HLA抗原的检测
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三、HLA抗原的检测
（一）HLA-A、B、C抗原的检测
HLA-A、B、C抗原可用血清学方法鉴定，故又称SD抗原（serologically defined antigen）,常采用微量淋巴细胞毒性试验（microlymphocytotoxicity test）,又称补体依赖细胞毒试验（complement dependent cytotoxicity,CDC）。基本步骤是分离纯化外周血中的淋巴细胞，加一组已知HLA抗血清，20℃60分钏后，再加家兔补体，37℃ 60分钏后加台盼兰染色观察结果，如淋巴细胞染成兰色则为阳性，表明待检淋巴细胞表面具有与已知抗血清相应的抗原。也可用 51 Cr标记的细胞毒试验。
（二）HLA-DR、DQ抗原的检测
HLA-DR、DQ抗原检测的基本方法是采用微量淋巴细胞毒性试验。先从待检者外周血中分离纯B细胞，阳性血清可来自经产妇，但需用血小板吸收以除去抗HLA-A、B、C抗体。标准抗血清的主要有以下几种来源。
（1）经产妇血清：在多胎生产的妇女中，可得到抗HLA-A、B和C抗原的抗血清。因为胎儿的HLA抗原包含了父方抗原（因其中一个单倍体来自父方），在分娩时，由于胎盘损伤等原因，胎儿的父方抗原免疫了母方，从而在母体内产生抗HLA抗血清，这种抗血清可能具有多种特异性，但多胎后，其中免疫原性最强的一种抗原可刺激诱导得到单一特异性抗血清。
（2）计划免疫志愿者的血清：给志愿者注射不相容的HLA淋巴细胞，受者产生特异性HLA同种抗体，可用于HLA-A、B、C、DR和DQ分型。
（3）单克隆抗体：至今报道的大都是经种间免疫（鼠抗人）获得，小鼠免疫系统识别人HLA抗原所产生的鼠抗人单抗不同于从经产妇获得的HLA抗血清，HLA抗原分子最易为鼠免疫系统识别的畅叙有种间送别的决定簇，
所以应用鼠杂交瘤技术获得HLA单抗大部分都是识别种间差异的共同决定簇，所谓单态性HLA单抗。已获得数百种HLA单抗中，仅少数为多态性HLA-A、B、C单抗。而在已获得的多态性单抗中也集中某几个少数的特异性抗原，要获得多数特异HLA单抗有赖于人-人杂交瘤技术的应用。第11次IHW报道用克隆的HLA等位基因转染小鼠L细胞，获取特异HLA抗原专一表达相应产物的转染细胞（transfactent）以筛选相应的HLA单克隆抗体。现已从70多个转染细胞中获得抗HLA多态部分的单抗约50多种，特别针对难以检出的DP以及部分DQ抗原的单抗，这些细胞和基因工程产生的制剂具有精细的分辨力，有助于确定各种HLA等位基因产物的结构和各人群特异性抗原的检测和分析。
（三）HLA-D抗原的检测
以往HLA-D抗原用混合淋巴 细胞培养 （mixed lymphocyte culture）来鉴定，故又称LD抗原（lymphocyte defined antigen），有双向MLC和单向MLC两种分型法。
1.双向MLC 供者和受者淋巴细胞在体外共同孵育时，由于Lads抗原不同而相互刺激转化为母细胞。供者和受者组织相容性愈差，相互刺激也愈强，转化率就愈高。双向MLC缺点是操作方法复杂，稳定性与重复性差，一般要5-7天，对尸体供肾者多无法预先测定。
2.单向MLC 属于阴性分型法，基本步聚是将已知HLA-D抗原的淋巴细胞用丝裂霉素C（mitomycin C）或X线照射处理，成为只有抗原激发能力而无增殖反应能力的“刺激细胞”。将刺激细胞与末经过这种处理的待测淋巴细胞进行混合培养，根据待测细胞出现母细胞反应的程度，则可知待测淋巴细胞上是否具有与“刺激细胞”上相同的HLA-D抗原。在MLC起激发抗原的主要是B细胞和单核细胞上的D抗原，反应细胞为CD4阳性T细胞。本法特点同双向MLC。在单向MLC中作为刺激细胞最好用纯合子配型细胞（homozygous typing cell,HTC）,因为纯合子是两个单体型完全相同，因此只有一种D抗原。
纯合子分型细胞的来源：
（1）姨姑表婚配的子女约占1/16的机率找到纯合子细胞。
（2）多发性硬皮病患者中表现为HLA-D2和HLA-B7连锁不平衡的个体具有异常高的纯合子频率。
（3） 风湿性关节炎 患者D位点纯合的发生率也较高。
图6-12 姑姨表婚配的HLA单体型的遗传模式图
（四）HLA-DP抗原的检测
HLA-DP抗原的检测可采用预处理淋巴细胞分型试验（primed lymphocyte typing test,PLT）基本步骤是首先取有一个单倍体相同的两个个体的淋巴细胞进行混合培养，这在双亲与子女间很容易找到，如亲代a/b,子代a/c。先将a/c经X线照射作为刺激细胞，则反应细胞a/b只对c单倍体抗原起反应。经9-14天混合培养，反应细胞分裂增殖逐渐停止，最后培养中留下已致敏的记忆细胞，称为预处理细胞或PLT分型细胞，液氮保存。当被检者淋巴细胞含c单倍体抗原，则预处理细胞表现一种迅速的回忆反应，在24-30小时内迅速发生增殖。因此本法属于阳性分型法。
（五）HLA的DNA分型及评述
1991年11月召开的11届IHW上提出了HLA的DNA分型方法，使得HLA多态性的检测有了突破性的进展，这些方法众多，现列举如下。
（1）PCR-ASO（或PCR-SSO）：即PCR技术与等位基因特异顺序的寡核苷酸（allelic specific oligonucleotide,ASO）或顺序待异性的寡核苷酸（sequence specific oligonucleotide,SSO）探针相结合的方法。用PCR技术扩增从需定型细胞中抽提出的高度多态性基因片段的DNA，再与特异的序列明确的寡核苷酸（SSO）探针杂交，可区分特定编码区DNA顺序的细微差别。
（2）PCR-RFLP：即PCR技术与限制性片段长度多态性（restriction fragment lengthpolmorphism,RFLP）分析技术相结合。HLA抗原多态性是由其编码基因的碱基顺序不同的结果。不同个体HLa DNA碱基顺序的差别造成了限制性内切酶切位点的不同，从而导致DNA电泳后限制性片段长度上的多态性。主要步聚是经印迹法转移到硝酸纤维膜上，然后用已知的cDNA探针进行杂交，经放射自显影可查知相应基因的何种长度的DNA酶切片段上。但此技术所用的内切酶量大，方法复杂，耗费昂贵，已更先进、精确的以PCR为基础的其它DNA分型所取代。
（3）PCR-SSCP：即PCR与单链构象多态性（single strand conformation polymorphism,SSCP）分析相结合的方法。其原理是单链DNA可形成稳定的构象，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中其迁移率不仅与链的大小有关，而且受链的核苷酸顺序的影响。由于使用相同引物扩增产物长度-致因而单链DNA在电泳中的迁移格局反映了单链核苷酸组成的不同，可十分敏感地检测等位基因间DNA顺序的微小差别，目前此技术已应用于DP等位点的分型。
尽管采用DNA水平的HLA分型工作有了很大进展，但血清学分型，特别对I类基因产物仍是分型基础。在可以预见的时期内，DNA分型是无法取代它的。但应该强调，在第11次IHW及随后召开的WHO-HLA命名委员均已早明，今后凡属新HLA特异性必须有相应的DNA序列为基础，否则不再予以命名。
应该看到，HTC与PLT在对HLA-D和HLA-DP特异性检测上有过肯定的贡献，但由于方法较为复杂，耗时费力，且影响因素多，精确程度有限，已逐渐被众多DNA水平定型方法所取代。
