IHC 常用试剂配方集锦：其他

　 一、缓冲液

　　免疫细胞化学中应用的缓冲液种类较多，即使是同种缓冲液，其浓度、pH、离子强度等也常常不同。在此介绍几种最常用的缓冲液的配制。

　　1．0.2mol/L(pH7.4)磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer, PB）

　　试剂： NaH2PO4·2H2O

　　Na2HPO4·12H2O

　　配制方法：配制时，常先配制0.2mol/L的 NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（PB），根据需要可配制不同浓度的PB和PBS。

　　（1）0.2mol/L的 Na2HPO4；称取Na2HPO4.12H2o 31.2g(或 NaH2PO4·H2O 27.6g)加重蒸水至1000ml溶解。

　　（2）0.2mol/L的 Na2HPO4：称取NaHPO4.·12H2o 71.632g（或 Na2HPO4·7H2O 53.6g或 Na2HPO4·2H2o 35.6g）加重蒸水至1000ml溶解。

　　 （3）0.2mol/L pH7.4的PB的配制：取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4和81ml 0.2mol/L的 Na2HPO4·12H2O,充分混合即为0.2mol/L的PB（pH约为7.4～7.5）。若pH偏高或偏低，可通过改变二者的比例来加以调整，室温 保存即可。

　　2．0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水（Phosphate Buffered Saline, PBS）

　　试剂：0.2mol/L PB　　　50ml

　　NaCl 　　　　　　　　　8.5～9g(约0.15mol/L)

　　重蒸水 　　　　　　　　至1000ml

　　配制方法：称取NaCl 8.5～9g及0.2mol/L的PB 50ml，加入1000ml的容量瓶中，最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀即可。若拟配制0.02mol/L的PBS，则PB量加倍即可，依此类推。

　　PB和PBS是免疫细胞化学实验中最为常用的缓冲液，0.01mol/L的PBS主要用于漂洗组织标本、稀释血清等，其pH应在7.25～7.35之 间，否则需要调整。0.1mol/L的PB常用于配制固定液、蔗糖等。一般情况下，0.2mol/l PB的pH值稍高些，稀释成0.01mol/L的PBS时，常可达到要求的pH值，若需调整pH，通常也是调PB的pH。

　　3．Karasson –Schwlt’s磷酸盐缓冲液

　　试剂： NaH2PO4·H2O　　3.31g

　　Na2HPO4·7H2O　　　　　33.77g

　　重蒸水 　　　　　　　　至1000ml

　　配制方法：同前

　　该缓冲液主要用于配制Zamboni’s固定液。

　　4．0.5mol/L pH7.6的Tris- HCl缓冲液。

　　试剂：Tris(三羟甲基氨基甲烷)　　60.57g

　　1N HCl　　　　　　　　　　　　　约420ml

　　重蒸水 　　　　　　　　　　　　至1000ml

　　配制方法：先以少量重蒸水（300～500ml）溶解Tris,加入HCl后，用1N的HCl或1N的NaOH将pH调至7.6，最后加重蒸水至 1000ml。此液为储备液，于4℃冰箱中保存。免疫细胞化学中常用的Tris-HCl缓冲液浓度为0.05mol/L，用时取储备液稀释10倍即可。

　　该液主要用于配制Tris缓冲生理盐水（TBS）、DAB显色液。

　　5．Tris缓冲生理盐水（Tris Buffered,Saline,TBS）

　　试剂：0.5mol/L Tris-HCl缓冲液　　　100ml

　　NaCl　　　　　　　　　　　　　　　3.5～9g(0.15mol/L)

　　重蒸水　　　　　　　　　　　　　　至1000ml

　　配制：先以重蒸水少许溶解NaCl,再加Tris-HCl缓冲液，最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀使Tris终浓度为0.05mol/L。

　　TBS主要用于漂洗标本，常用于免疫酶技术中。

　　6．Tris-TBS(PBS)

　　试剂：Triton X-100　　　　　　　10ml(1%)或3ml(0.3%)

　　0.5mol/L Tris缓冲液（pH7.6）　　1000ml(50ml)或(0.2mol/L的PB)

　　NaCl　　　　　　　　　　　　　　8.5～9g

　　重蒸水　　　　　　　　　　　　　至1000ml

　　配制方法：先以重蒸水少许溶解NaCl后，加入Triton X-100及Tris缓冲液或（PB），最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀。

　　该液常用浓度为1%及0.3%，前者主要用于漂洗标本，后者主要用于稀释血清。

　　7．0.1mol/L（pH7.4）二甲胂酸缓冲液

　　试剂：0.2mol/L二甲胂酸钠　　　　　　500ml

　　0.1N HCl　　　　　　　　　　　　　　28ml

　　蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　　至1000ml

　　配制方法：先称取二甲胂酸钠（MW：214）42.8g,加蒸馏水至1000ml，使0.2mol/L的二甲胂酸钠溶液；再取HCl 1.7ml加蒸馏水至1000ml ,配成0.1N，最后 取0.2mol/L二甲胂酸钠溶液500ml及0.1n HCl 28ml混合，加蒸馏水至1000ml，即为0.1mol/L的二甲胂酸钠缓冲液。

　　8．几种常用的不同pH值缓冲液的配制表

　　（1）0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH5.7～8.0）

pH
0.2mol/L NaH2PO4(ml)
0.2mol/L Na2HPO4(ml)

5.7
93.5
6.5

5.8
92.0
8.0

5.9
90.0
10.0

6.0
87.7
12.3

6.1
85.0
15.0

6.2
81.5
18.5

6.3
77.5
22.5

6.4
73.5
26.5

6.5
68.5
31.5

6.6
62.5
37.5

6.7
56.5
43.5

6.8
51.0
49.0

6.9
45.0
55.0

7.0
39.0
61.0

7.1
33.0
67.0

7.2
28.0
72.0

7.3
23.0
67.0

7.4
19.0
81.0

7.5
16.0
84.0

7.6
13.0
87.0

7.7
10.5
89.5

7.8
8.5
91.5

7.9
7.0
93.0

8.0
5.3
94.7

　　(2)0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.19～9.10）

pH
0.2mol/L Tris(ml)
0.2mol/L HCl(ml)
H2O

7.19
10.0
18.0
12.0

7.36
10.0
17.0
13.0

7.54
10.0
16.0
14.0

7.66
10.0
14.0
15.0

7.77
10.0
14.0
16.0

7.87
10.0
13.0
17.0

7.96
10.0
12.0
18.0

8.05
10.0
11.0
19.0

8.14
10.0
10.0
20.0

8.23
10.0
9.0
21.0

8.32
10.0
8.0
22.0

8.41
10.0
7.0
23.0

8.51
10.0
6.0
24.0

8.62
10.0
5.0
25.0

8.74
10.0
4.0
26.0

8.92
10.0
3.0
27.0

9.10
10.0
2.0
28.0

　　(3)0.2mol/L醋酸盐缓冲液（pH3.6～5.6）

pH
0.2mol/L醋酸（ml）
0.2mol/L醋酸钠（ml）

3.6
46.3
3.7

3.8
44.0
6.0

4.0
41.0
9.0

4.2
36.8
13.2

4.4
30.5
19.5

4.6
25.5
24.5

4.8
20.0
30.0

5.0
14.8
35.2

5.2
10.5
39.5

5.4
8.8
41.2

5.6
4.8
45.2

　　(4)0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH5.0～7.4）

pH
0.2mol/L二甲胂酸钠（ml）
0.2N HCl(ml)
蒸馏水

5.0
25
23.5
51.5

5.2
25
22.5
52.5

5.4
25
21.5
53.5

5.6
25
19.6
55.5

5.8
25
17.4
57.5

6.0
25
14.8
60.3

6.2
25
11.9
63.1

6.4
25
9.2
65.8

6.6
25
6.7
68.3

6.8
25
4.7
70.3

7.0
25
3.2
71.8

7.2
25
2.1
72.9

7.4
25
1.4
73.6

　　注：HCI可由NCO3代替，配制成二甲胂酸钠-HNO3缓冲液。

　　（5）0.2mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.2～10.7）

pH
0.2mol/L Na2CO3(ml)
0.2mol/L NaHCO3(ml)

9.2
4.0
46.0

9.3
7.5
42.5

9.4
9.5
40.5

9.5
13.0
37.0

9.6
16.0
34.0

9.7
19.5
30.5

9.8
22.0
28.0

9.9
25.0
25.0

10.0
27.5
22.5

10.1
30.0
20.0

10.2
33.0
17.0

10.3
35.5
14.5

10.4
38.5
11.5

10.5
40.5
9.5

10.6
42.5
7.5

10.7
45.0
5.0

　　三、显色液

　　免疫细胞化学中，由于抗原-抗体反应所形成的复合物本身无色，无法直接观察，因而需借助于某些化学基团的呈色作用，使其得以显示，以利于在显微镜下观察。常用的显色液有：

　　1．DAB（Diaminobenzidine）显色液

　　DAB即3，3-二氨基苯联胺

　　试剂：DAB（常用四盐酸盐）　50mg

　　0.05mol/L TB 　　　　　　　100ml

　　30% H2O2　　　　　　　　　30～40μl

　　配制方法：先以少量0.05mol/L(pH7.6)的TB溶解DAB，然后加入余量TB，充分摇匀，使DAB终浓度为0.05%,过滤后显色前加入30%的H2O230～40μl，使其终浓度为0.01%。

　　DAB显色液主要用于免疫过氧化物酶法（如酶标法、PAP法等），其终产物可直接在光镜下观察，也可经OsO4处理后，增加反应产物的电子密度，用于 电镜观察。

但有几点需注意：DAB溶解要完全，否则未溶解的颗粒沉积于标本上影响观察；DAB浓度不易过高，否则显色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB 有致癌作用，故操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗，接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24h后使用。

　　2．4-氯-1-萘酚（4-Cl-1-Naphthol）显色液

　　配方1：4-Cl-1-萘酚 　　　　　　　　100mg

　　纯乙醇　　　　　　　　　　　　　　 10ml

　　0.05mol/L TB(pH7.6)　　　　　　　　190ml

　　30% H2O2　　　　　　　　　　　　 10μl(0.003%)

　　配制方法：先将4-Cl-1-萘酚溶解于乙醇中，然后加入Tb 19ml，用前加入30% H2O2使其终浓度为0.005%，切片显色时间通常为5～20min。

　　配方2：4-Cl-1-萘酚

　　N-二甲基甲酰胺（DMF）

　　0.05mol/L TB(pH7.6)

　　30% H2O2

　　配制方法：先将4-Cl-1-萘酚加入DMF中，加热溶解使呈乳白色，再加入TB，乳白色变为絮状，在7.5℃加热5min后加入H2O2，搅动使絮 状消失，趁热过滤，当降至略低于50℃时才放入组织标本（注意：温度过高易损伤标本，过低则易重新出现沉淀）。显色时间通常为5min左右。

　　4-Cl-1-萘酚的终产物显示蓝色。

　　多数认为最好去除白色沉淀（如上述），但Larsson等认为，白色沉淀可作为背景，使阳性部位更易观察。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚显色的组织标本，勿用酒精脱水。

　　3．3-氨基-9-乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole,AEC）显色液

　　试剂：AEC　　　　　　　　　　　20mg

　　二甲基甲酰胺（DMF）　　　　　　2.5ml

　　0.05mol/L醋酸缓冲液（pH5.5）　　50ml

　　30%H2O2　　　　　　　　　　　　25ml

　　配制方法：先将AEC溶于DMF中，再加入醋酸缓冲液充分混匀。临显色前，加入30%H2O2。切片显色时间为5～20min。

　　该显色液作用后，阳性部分呈深红色，加以苏木精或亮绿等作为背景染色，则效果更佳。由于终产物溶于酒精和水，故需用甘油封固。

　　4．TMB显色液

　　试剂：TMB

　　HCl

　　亚硝基铁氰化钾

　　无水酒精

　　配制方法：

　　（1）醋酸盐缓冲液：取1.0mol/L的HCl 190ml加入1.0mol/L的醋酸钠400ml中混合，再加蒸馏水稀释至1000ml，用醋酸或NaOH将pH调至3.3。

　　（2）A液：取上述缓冲液5ml，溶解100mg亚硝基铁氰化钾，加蒸馏水92.5ml混合。

　　（3）B液：称取5mg TMB加入2.5ml无水酒精中，可加热至37℃～40℃直到TMB完全溶解。

　　（4）孵育液：放入标本前数秒，取2.5ml B液及97.5ml A溶于试管中充分混合。（液体在20min内应保持清亮的黄绿色，否则可能已有污染）。酶反应时，加入终浓度为0.005%的H2O2。

　　（5）主要显色步骤：组织标本在蒸馏水（或PBS）中漂洗数次（每次约10～15min）后放入未加H2O2的孵育液中作用 20min（19℃～30℃），然后向孵育液中放入H2O2（每100ml孵育液中加0.3%的H2O2 1.0～5.0ml）继续孵育液20min左右（19℃～23℃），捞出标本漂洗数次（共30min左右）。

在0～4℃条件下可在漂洗液放置4h直至贴 片、脱水，封片。也可在贴片前在1%的中性红中负染2～3min，也可在1%派诺宁（pH3.3～3.5）中负染5min后贴片、脱水、封片。

　　TMB即四甲基联苯胺（Tetrabenzidine）是一种脂溶性较强的基团，因此容易进入细胞与细胞器中的HRP反应，且由于这种高度的脂溶性， 使其易形成多聚体，在HRP活性部位产生粗大的、深兰色沉淀物，这使得TMB成为组化实验中的一种很好的发色团。

同时反应产物的沉淀，使得HRP的活性部 位更加暴露，利于酶氧化反应进行。TMB的反应产物为深蓝色，利于光镜观察，且反应产物越聚越大，常超出单个细胞器的范围（而DAB则被限制在其内），故 TMB反应的检测阈较低。

由于上述优点，目前TMB常用于光镜及超微结构水平的HRP及HRP-WGA神经投射的研究。需要注意的是：TMB显色液中的A 液和B液应在2h内新鲜配制。另外，TMB是一种较强的皮肤刺激剂，并有致癌的潜在可能，故使用时应带手套及在通风条件下操作。

　　5．NBT显色液

　　试剂A液：5%NBT：称 取0.5gNBT溶于10ml 70%的DMF（二甲基甲胺）内，充分混合，常存于4℃，也可装成小份，-20℃保存，用前复温。

　　B液：5% BCIP：称取BCIp 0.5g溶于10ml 100%的DMF内，混匀。4℃或分装存于-20℃，用前恢复至室温。

　　C．显色液：取A液40μl，加入到盛有10ml的0.1mol/l Tris-HCl(pH9.5,钤0.1mol/L NaCl、5mmol/L MgCl2)管内，充分混匀；再加入B液40μl，轻轻混合即可。最好用前新鲜配制。

　　NBT即四唑氮蓝（Nitro-Blue-Tetrazolium）,MW=818,为深蓝色无定形微溶物质。BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚- 磷酸盐（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate）。当二者存在时，在碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP）作用下，NBT被还原形成显微镜下可见的蓝色或紫色沉淀。

　　四、粘附剂

　　在免疫细胞化学工作中，由于标本（如切片）的脱落常影响工作的质量的速度，故粘附剂的选择和使用就显得较为重要。

　　1．铬矾明胶液

　　试剂：铬矾　　　　　　　　0.5g

　　明胶（Gelatine）　　　　　5g

　　H2O　　　　　　　　　　 ~1000ml

　　方法：在1000ml的烧杯或烧瓶中，以500～800ml H2O加温溶解明胶，待其完全溶解后，再加入铬矾。注意温度过高易使明胶烧糊，包被玻片时最好控制水温在70℃。如有明显残渣，过滤后使用。

　　2．甲醛-明胶液

　　试剂：40%甲醛　　　　　　2.5ml

　　明胶　　　　　　　　　　0.5g

　　蒸馏水　　　　　　　　　至100ml

　　配制方法：用少许蒸馏水（约80ml）加热溶解明胶，待完全溶化后，加入甲醛，最后补充蒸馏水至100ml混匀即可。

　　3．多聚赖氨酸（Poly-L-Lycine,PLL）

　　试剂：多聚赖氧酸　　　　　 5g

　　蒸馏水　　　　　　　　　　 ~1000ml

　　配制方法：称取PLL，溶于H2O，充分混合即可，此液浓度为0.5%，可适当稀释配成0.01～0.5%浓度。4℃保存，也可-20℃备用。PLL可反复冰冻，效果无明显影响，工作液常再稀释10～50倍。

　　4．Vectabond试剂　　该试剂是Vector公司新进推出的一种新型玻片粘附剂。该试剂与一般的粘附剂不同，它是通过对玻璃表面起化学修饰作 用，改变其表面的化学物理特性，使组织切片牢固地贴于玻璃片上，贴上后不易脱落，保留时间较久。一个试剂盒（7ml）可配成350ml工作液（用丙酮 配）。处理载玻片前（事先酸处理），用染色缸装好各种液体，按下列程序进行：

　　干净载玻片→丙酮5min→Vectabond试剂工作液（7ml Vectabond+ 350ml丙酮）：将载玻片用镊子夹住浸入Vectabond试剂1～2次→dH2O，2×5min→干燥（37℃过夜）→用铝箔包好，室温存放备用。

　　注意：避免污染（尘埃等）。

　　综上述方法处理的载片一般可存放半年以上。

　　五、封固剂

　　1．甘油-TBS及甘油-PBS

　　配制方法：按比例将甘油和TBS（或PBS）充分混合后，置4℃，冰箱静止；待气泡排除后方可使用。

　　2．甘油-明胶（冻）

　　试剂：明胶　　　　 10g

　　甘油 　　　　　　　12ml

　　蒸馏水　　　　　　 100ml

　　香草酚　　　　　　 少许

　　配制方法：称取1g明胶于温热（约40℃）的蒸馏水中，充分溶解后过滤，再加入12ml甘油混合均匀。少许香草酚是为了防腐。

　　3．液体石蜡　　液体石蜡因含杂质少，很少引起非特异性荧光，故常用于荧光组化及免疫荧光法时标本的封固。

　　4．DPX

　　试剂：Distrene 　　　10g

　　酸二丁　　　　　　　 5ml

　　二甲苯　　　　　　　35ml

DPX 为中性封固剂，用于多种染色方法匀不易褪色，但组织收缩较明显，故应尽量使其为均匀的一薄层。DPX现有商品出售，可直接应用。若感过于粘稠，也可加少量 二甲苯稀释后应用。注意：二甲苯不可加得太多，二甲苯挥发后，片子上出现许多干燥的空泡，影响观察，遇有这种情况，可用二甲苯浸泡掉盖玻后重新封固。

　　六、酶消化液

　　1．0.1%胰蛋白酶

　　试剂：胰蛋白酶 　　　　　0.1gm

　　0.1%氯化钙（pH7.8）　　　100ml

　　配制方法：先配制0.1%的CaCl2,用0.1mol/L的NaOH将其pH调至7.8，然后加入蛋白酶溶解之。用前将胰蛋白酶消化液在水浴中予热至37℃（载有标本的玻片也在TBS中予热至同样样温度）。该消化液时间约为5～30min。

　　2．0.4%胃蛋白酶

　　试剂：胃蛋白酶 　　　　　400mg

　　0.1N HCl　　　　　　　　 100ml

　　配制方法：同胰蛋白酶。消化时间在37℃约为30min。

　　3．0.06% Pronase

　　试剂：Pronase　　　　　　　0.06g

　　0.05mol/L TB(pH7.5)　　 　100ml

　　配制方法：同前。

　　在免疫细胞化学染色中，有时经Formalin过度固定的标本，常会产生过量的醛基，遮盖抗原，影响一抗与抗原的结合。用蛋白酶溶液消化，可起到暴露 抗原部分的作用。消化时间应根据不同组织而异，总之，在保持组织形态不被破坏的前提下，宜尽量延长消化时间。以上三种酶消化液中，以第一种最为常用。

　　七、其它

　　1．蔗糖溶液　　免疫细胞化学中应用的蔗精，常用浓度为5%～30%。一般光镜研究，仅用20%蔗糖处理已足矣，若制备电镜标本，在冰冻前最好经上行蔗糖（5%、10%、15%、20%及20%蔗糖-5%甘油等）处理，以确保其良好的细微结构。

　　（1）20%蔗糖液：

　　试剂：蔗糖 　　　　　　　　　　20g

　　0.1mol/L PB(pH7.5)　　　　 　　至100ml

　　配制方法：先以少许0.1mol/L的PB溶解蔗糖，再加0.1mol/l PB至100ml充分混合，置4℃冰箱保存。

　　该液多用于纯光镜研究。标本在刚放入浓度如此高的蔗糖液，常浮在上面，当标本沉到底部时即可。通常光镜标本浸泡在20%蔗糖液中过夜。都能达到要求。

　　（2）20%蔗糖-5%甘油：

　　试剂：蔗糖　　　　　　 20g

　　甘油 　　　　　　　　　5ml

　　0.1mol/L PB　　　　　　至100ml(约95ml)

　　配制方法：先用少许PB溶解蔗糖后，再加入甘油，充分混匀，最后补足PB至100ml，于4℃保存备用。

　　该液主要用于电镜标本的处理，常浸泡过夜（其它浓度的蔗糖中常分别为2h左右）。

　　蔗糖是一种廉价的防冻剂，兼有脱水的作用，它可减小标本在冰冻切片时冰晶形成的数量和大小，应用较