【资源】自己整理的慢病毒质粒的知识

慢病毒——基因转移的潜在新载体

　　用于基因治疗的载体系统可分为病毒性载体和非病毒性载体两类。目前常用的病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体等,但是这些载体均存在不足之处,严重影响了基因治疗的有效性及安全性。

在基因治疗中广泛应用的逆转录病毒载体存在的主要问题,是无法高效转导非分裂期细胞,而腺病毒载体虽然能转导非分裂期细胞,但在体内不能实现目的基因稳定的长期表达,且反复应用容易引起免疫反应。

慢病毒载体不但可以感染非分裂期细胞,还具有容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点,在基因治疗中具有广泛的应用前景。现以HIV-1 为例,就慢病毒载体的生物学特征、慢病毒载体的构建、在基因治疗中的应用以及生物安全性等 方面作一综述。

一、 慢病毒载体的生物学特征

慢病毒包括灵长类慢病毒,如人 类免疫缺陷病毒(HIV) 和猴免疫缺陷病毒(SIV) ,以及非灵长类慢病毒如猫免疫缺陷病毒( FIV) 、马传染性贫血病毒(EIAV) 、牛免疫缺陷病毒(BIV) 和维斯纳-梅迪病毒(VMV)等。目 前,HIV-1、HIV-2、SIV、FIV 及EIAV被广泛研究用作基因治疗的载体,而其中又以HIV-1最为热门。
1.1 HIV-1 病毒形态与结构

成熟的HIV-1 病毒直径100～120nm、呈20 面体对称结构、球形,电镜下可见一致密圆锥状核心,内有病毒RNA 分子和酶,后者包括逆转录酶、整合酶(integrase) 和蛋白酶(protease)。

HIV-1的最外层为脂蛋白包膜,膜上有表面蛋白 (gp120) 和相嵌蛋白(gp41) 两种糖蛋白,gp120为刺突,gp41为跨膜蛋白。包膜内面为P17 构成的基质蛋白(matrix) ,包膜内为衣壳蛋白(P24)包裹的RNA

1.2 HIV-1 病毒基因组结构及其功能特征

HIV-1 的基因组由两条相同的正股RNA 链在5′端通过部分碱基互补配对而成二聚体。病毒基因组全长约9200bp ,含有gag、 pol、env3 个结构基因以及tat 、rev、nef 、vif 、vpr 、vpu 6 个调节基因。

在病毒基因 组的5′端和3′端各有相同的一段核苷酸序列,称为长末端重复序列(long terminal repeat ,LTR) 。gag基因编码p55的蛋白前体,经蛋白酶裂解而形成病毒的核衣壳蛋白(p7) 、内膜蛋白 (p17) 和衣壳蛋白(p24) 。

pol 基因编码病毒复制所需的酶类,env 编码gp120 和gp41 两种包膜 糖蛋白,决定病毒感染宿主的靶向性。tat 基因编码的gp14 是一种反式激活的转录因子,与LTR 结合后能促进病毒所有基因的转录。

rev 基因编码的产物gp19 能促进未经拼接的大mRNA 分子从细胞核向胞浆转运,并相对减少拼接后小mRNA 分子的数量。nef 基因编码负调节蛋白,对病毒的 结构蛋白和调节蛋白的表达均有下调作用。vif 编码产物与病毒体的感染性有关,vpu 产物与病毒的装配、成熟和释放有关,而vpr 编码产物的功能尚不清楚。

1.3 HIV-1 生活史

HIV-1 病毒通过gp120 与宿主细胞的CD4 分子和趋化因子受体结合,然后将病毒的基因(RNA) 、蛋白及酶等释放到宿主细胞内;随后,逆转录酶将病毒RNA 转录成DNA,病毒DNA 在整合酶的作用下插入宿主细胞核的基因组中,此时的病毒DNA 也称为原病毒;

紧接着,原病毒转录成mRNA ,mRNA 从细胞核进入细胞质,并利用宿主细胞的原料合成病毒的各种成分(蛋白质) ,新合成的各种蛋白、酶及RNA 等聚集在宿主细胞的膜下,病毒的包膜蛋白(gp120 ,gp41) 插入宿主细胞的细胞膜并形成一种未成熟的病毒(此时病毒无传染性) ;

最后蛋白酶将病毒核心中的许多过长的蛋白及酶切短,便形成成熟的病毒。病毒利用宿主细胞的细胞膜将自己包被起来,离开该细胞去寻找新的宿主。

1.4 　慢病毒载体转导非分裂期细胞的分子机制

慢病毒载体能转导非分裂期细胞,3 种分子元件决定了这种能力:MAN、IN 和vpr 。这3 类蛋白利用细胞核的输入机制,靶向作用于细胞核的前整合复合物( PIC)。细胞核的输入系统包括: 胞质蛋白、importin-a 、importin-b 及核 孔蛋白。

importin-a含有一个细胞定位序列(NLS) 的结合位点,当含有NLS的蛋白与importin-a 结合在一起,发生构象变化,与importin-b 相互作用,然后importin-b通过与核孔蛋白结合,靶向 作用于核孔复合物。而在实际构建时,vpr 可以完全敲除而不影响慢病毒载体感染非分裂期细胞的能力。

二、 慢病毒载体的构建

2.1 　早期HIV21 来源的慢病毒载体

早期构建的HIV21 来源 的慢病毒载体,是作为研究HIV21生物特性的工具,而非作为基因转移载体。该慢病毒载体包含了完整的病毒基因组,仅仅是在env 基因框内插入了一个报告基因,由于存在病毒滴度较低,以及产生有复制能力的反转录病毒(RCR) 的巨大风险,这种载体从未被考虑用于基因治疗。但是,这种载体可以应用于病毒的生物学研究。

2.2 　第一代HIV-1 来源的慢病毒载体

以Naldini以及Kafri构建的三质粒系统为代表。该载体系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3 种质粒组成。载体质粒携带了5′端LTR 和全部5′端非翻译区域(包括gag 编码序列的350 个核苷酸) ,另外还带有rev 应答元件(Rev responsive element ,RRE) 及3′端LTR。

其瞬时表达盒采用巨细胞病毒(CMV) 启动子及增强子元件,在某些研究领域,可以携带绿色荧光蛋白基因、荧光素酶基因或半乳糖苷酶基因作为生物标记。包装质粒由HIV-1 前病毒基因组作简单修改得到,其5′端LTR 由异源病毒启动子/ 增强子元件取代。

为了防止来自辅助质粒的RNA 衣壳化, 特意将5′端主要剪接供体位点 (splice donor site) 和gag 编码序列起始端之间的包装信号区(E/Ψ region) 删除,而下游的启动子由外源多聚腺苷酸信号(poly A)取代。另外,利用点突变将env 编码序列打断,但仍然保留rev 反应元件。

这样的辅助结构能表达所有的病毒蛋白,包括tat 及rev(env除外) 。env 由单独的包膜质粒携带并在病毒生产过程中共转染后表达。

本系统包膜质粒的改进之处在于,引入了VSV-G基因表达包膜结构,这样做的结果至少具有3个方面的积极意义:

①包膜的更换进一步降低了HIV-1 载体恢复成野生型病毒的可能;

②使HIV 载体感染宿主的范围不再仅限于CD4 + 细胞 ,而扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞;

③VSV 的包膜赋予HIV 载体颗粒高度的稳定性,使其能够通过超速离心而浓缩,达到高滴度。

使HIV-1 载体滴度由105 转录单位(TU) / ml 达到 108TU/ ml 。这样的改进无疑是HIV 载体系统走向应用而迈出的一大步

2.3 第二代HIV-1 来源的慢病毒载体

尽管第一代载体产生RCR 的几率极小,仍然不能忽略产生的可能性。毕竟包装质粒可以表达除env 外所有HIV-1 病毒蛋白,其中部分蛋白与HIV-1的毒力密切相关,且已发现部分蛋白对细胞存在潜在的毒害作用,比如:vpr 可引起细胞周期停滞,vif能抑制某些细胞的生长而Nef 能引起凋亡。

1997年,Zufferey 等将包装质粒上的 vif 、vpr 、vpu 和nef 基因敲除,从而得到第二代慢病毒载体,而其他方面与上述第一代载体系统一致。研究发现即使全部4 个调节基因都被敲除。病毒颗粒的产量也不会受到影响。

这种载体仍然具有体外感染非分裂期细胞、在体感染分化成熟大鼠神经元的能力,但是目前尚不能确定这种载体是否能转染全部种类细胞。由于敲除的调节基因与野生型HIV-1 病毒的生活周期以及毒力密切相关,所以这些载体即使发生多位点重组形成RCR ,亲代病毒仍不具有致病性。

2.4 　第三代HIV-1 来源的慢病毒载体

利用慢病毒来源的包装系统的最大问题在于生产过程中可能产生复制型病毒。当质粒DNA 转染进入包装细胞,以及辅助质粒及载体质粒的RNA 包装入同一病毒颗粒时,将有可能发生重组。减少这种可能性的方法之一就是减少辅助质粒与载体质粒的同源性。

另一个方法便是将gag/ pol 和rev 编码序列隔离,分散在不同的质粒 。

这样的包装系统需要四质粒来代替原有的三质粒包装系统。质粒一携带了gag/ pol 编码序列 及RRE;质粒二包含了编码rev 的序列;质粒三是载体质粒;质粒四表达env。采用四质粒代替三质粒系统、除去tat 均减少了产生复制型病毒的可能性,从而增加了载体系统的安全性。

2.5 　自身失活型(SIN) 慢病毒载体

由于具有逆转录方式的特点,在逆转录过程中存在于病毒基因组3′端U3 区的启动子/增强子元件将被复制,并置于前病毒两端的LTR。 因此,3′LTR 的U3 区启动子发生失活突变后,将在逆转录过程中转移至5′LTR。

如果这样的载体整合入靶细胞,将不会产生完整长度的载体RNA ,因此命名为“自身失活型载体”。这种技术最先应用于莫洛尼氏小鼠白血病病毒(MoMLV) 载体和鸟类的脾坏死病毒(SNV) 载体。进一步研究表明 ,U3 区的频繁突变将导致病毒滴度下降,原因是该区域的某些序列是载体有效多聚腺苷酸化所必需的。

在HIV-1 基因组内,核心多聚腺苷酸化信号存在R 区。现已证实,U3 区序列能影响多聚腺苷的酸化效率。与MoMLV 相比,将HIV-1的3′LTRU3 区(除上述多聚腺苷酸化增强相关序列,以及病毒整合酶识别的U3 区5′末端外) 删除后并不会影响滴度。

这种删除能确保病毒RNA 逆转录并整合入靶细胞染色体后,从5′LTR 端启动子起始的复制被有效抑制。这种设计的另一个优势是 能增强瞬时表达效率,这可能与减少了病毒LTR 和细胞启动子之间的启动子竞争有关。

2.6 　其它类型

在改进慢病毒载体生物安全性的同时, 科学家们在基因转移效率方面对病毒载体做了一些改构,以期提高目的基因的转导效率及在靶细胞中的表达效率。Zufferey 等将美洲旱獭肝炎病毒的翻译后调节元件(WPRE) 插至载体3′末端 。

翻译后水平WPRE可以促进转录物出核,还可以通过上调初级转录物的多聚腺苷化,来增加胞内信使RNA 总量,最终改进转移基因的表达效率。另外,科学家尝试在SIN 载体中修复118bp 的cPPT序 列,发现在分化与非分化灵长类动物细胞中,载体转导效率显著提高。

三、 慢病毒载体的包装

大部分研发人员目前都使用瞬时转染293T 细胞的方式生产病毒载体。这种方法的缺点在于生产获得的病毒载体可能会出现有缺陷的基因组。为了生产高质量的载体,必须筛选合适的包装细胞系,而建立包装细胞系的最大难点在于某些病毒蛋白具有细胞毒性。

比如, vpr 能诱导细胞停滞在G2期,不利于建立vpr 蛋白高表达的细胞系,病毒蛋白水解酶同样能水解细胞内的蛋白,不利于建立稳定表达病毒gag-pol 蛋白的细胞系;VSV-G蛋白的表达同样对细胞具有毒性。目前,为了建立合适的慢病毒载体包装细胞系,许多科学家都在尝试使用诱导型或可调节的启动子来克服病毒蛋白的细胞毒作用。

四、慢病毒载体滴度的测定

慢病毒载体滴度可以参考腺病毒载体滴度的检测方法,将病毒与293 细胞共培养后,通过流式细胞仪检测GFP 蛋白表达水平来分析病毒滴度,病毒滴度为表达GFP 的细胞数乘以相应稀释倍数。另外,还可以通过TaqMan PCR 检测细胞中病毒拷贝数的方法检测滴度。

五、 复制型慢病毒(RCL) 的检测

应用慢病毒的基因载体的首要问题就是复制型慢病毒(RCL) 的产生。虽然现在还没有明确的指导方针,但是目前多个国家都制定了复制型逆转录病毒(RCR) 的检测方法。

在实验室研究领域,科学家提出通过将病毒载体与293 细胞等指示细胞共培养,293 细胞传数代后检测细胞中是否含有gag 序列的方法来确定是否存在RCL 。

如果收集的病毒载体不含有RCL ,则与293 细胞共培养后不发生增殖,gag序列检测即为阴性。另外,还可以应用更为敏感的RT-PCR 检测gag 及VSV-GRNA 判断293 细胞上清中是否含有RCL 。

六、 慢病毒载体在基因治疗中的应用前景

6.1 　获得性免疫缺陷综合征的基因治疗

目前对于AIDS 的基因治疗方案,基本上是由反转录病毒载体将抗病毒基因体外导入CD4 + T 淋巴细胞或CD4+ 的造血祖细胞,再回输体内。

常用的抗病毒基因包括自杀基因、反义RNA、核酶、RNA诱饵的相应DNA序列,以及调节蛋白或结构蛋白的突变体基因等。由于这些治疗基因不能到达巨噬细胞和多能干细胞,因此难以重建免疫;此外,体外操作费用昂贵,不适于大规模应用。

HIV-1 载体的研究为AIDS 的基因治疗带来了新的希望,它可能具有以下优势:第一,HIV-1 自身的包膜蛋白env 包裹的载体颗粒可以将抗病毒基因直接运抵CD4 + T 淋巴细胞和巨噬细胞,适于直接的体内治疗,而包被了VSV 包膜的载体颗粒又能感染多能干细胞,有利于免疫重建;

第二,患者体内的野生型HIV-1 可将携带抗病毒基因的HIV-1 载体拯救出来,使载体扩增并扩散到周围更多的细胞中发挥抗病毒作用;第三,如果将抗病毒基因置于HIV-1 本身的长末端重复序列(LTR) 控制之下的转导细胞,则只有当HIV-1 感染该细胞时, tat 蛋白反式激活LTR中的TAR元件,抗病毒基因才会表达,使基因表达具有了靶向性。

6.2 　神经系统疾病的基因治疗

帕金森氏病是一种由于大脑纹状体内多巴胺水平降低而引起的退行性脑病,临床上以注射左旋多巴改善症状,但长期注射的不便及药物的副作用令患者难以承受。

较为理想的治疗方式是在脑内持续表达酪氨酸羟化酶(TH) ,使其催化酪氨酸转变为为左旋多巴;Alzheimer 氏病也是一种多因素引起的退行性脑病,造成大脑皮质和海马回神经元萎缩,通常采用神经营养因子防止神经元退化。

由于HIV-1 载体能够体内转导神经元并建立长期稳定的表达,因此上述疾病的慢病毒载体基因治疗将极具潜力。应用慢病毒载体进行胶质源性神经营养因子(GDNF) 、酪氨酸羟化酶(TH) 体内基因治疗,可改善PD 大鼠的旋转次数,保护多巴胺能神经元、防止神经元退化,起到治疗帕金森氏病及Alzheimer 氏病的效果。

6.3 　血液系统疾病的基因治疗

Pawliuk 等构建的βA珠蛋白基因变体βA-T87Q能阻止HbS 的多聚化,以HIV-1载体将该基因转染人造血干细胞,并能在人红细胞系可以表达。

在镰状细胞贫血(SCD) 小鼠模型移植人造血干细胞后,转基因获得长期表达,在循环血中99 %的红细胞及52%的血红蛋白有红系特异性转基因表达,镰状细胞贫血得到改善,血液学指标、脾脏肿大及特征尿浓缩功能缺陷得到纠正。

May 等构建含人β珠蛋白启动子和增强子调控的人β珠蛋白基因的HIV-1 载体,在载体转染的MEL 细胞中,正常β珠蛋白可达到正常内源性β珠蛋白产量的70 %以上,使Β-地中海贫血得以较好的纠正。

Yamada 等将Fanconi 贫血(FA)C 型患者的EB 病毒刺激转化的原始淋巴细胞作为靶细胞,用HIV-1 载体将FAC 型cDNA转入靶细胞,用丝裂霉素C药物抗性监测FA细胞表型的纠正情况,效果显著。

慢病毒载体以其独特的优势,在血友病的基因治疗中有较好的应用前景。Park 等构建EF-1α增强子/ 启动子调控hFⅧ或hF Ⅸ表达的HIV-1载体,经门静脉注入C57BL/6 小鼠,其血清hF Ⅸ水平随着载体数量的增加而增高,最高可达50～60 ng·ml - 1 ,这表明慢病毒载体在体内可以产生治疗水平的凝血因子。

目前,少数国外研究机构已经开展以慢病毒载体为基础的基因治疗临床试验研究。

6.4 　肝脏疾病的基因治疗

肝脏的基因治疗策略通常是“增加基因”,通过导入正常的基因,代替缺陷或缺失的内源基因起到治疗作用。如苯丙酮尿症、酪氨酸血症、Wilson′s 病和LDL受体缺陷症等。Nguyen 等证实了来源于第三代HIV-1 载体能够有效的控制传递、整合、稳定表达转基因进入人原代肝细胞。可以预计,利用慢病毒载体来介导治疗基因进入肝细胞内,将起到一定疗效。

6.5 　其　他

最近,Goldman 等用HIV-1载体进行了尝试,动物实验表明,导入CFTR 基因后囊性纤维化(CF)缺陷可被纠正。但同时也发现,HIV-1 载体转导分化中的呼吸道上皮细胞效果较好,而对完全分化的上皮细胞的转导效率则非常低。

目前尚不完全清楚转导受限的机制。色素性视网膜炎是一种遗传性的进行性视网膜退变,症状包括视野进行性减小、夜盲、视网膜色素沉着等。研究发现, 将视杆细胞cGMP磷酸二酯酶-γ亚单位基因导入感光细胞,有可能纠正视网膜退变。

由于成熟的视网膜细胞绝大部分为终末分化细胞,在选用载体系统上受到很大限制,慢病毒载体以其转导非分裂期细胞的能力,给该疾病的治疗带来了希望。

七、生物安全性

慢病毒载体安全性方面最令人关注的是重组产生具有复制能力的逆转录病毒(RCR) 。病毒载体颗粒通过包装元件和含病毒基因组质粒共转染包装细胞系如人类胚胎肾细胞而产生,病毒载体颗粒的核心和酶的成分来源于HIV-1 ,衣壳来源于另一病毒,最常见的是VSV ,其产物G蛋白具有高度的稳定性和广泛的亲嗜性。

最新一代的慢病毒载体(第3 代)只含有HIV-1共9 个基因中的3个,即gag、pol 、rev。由于HIV-1基因组成分中60%被去除,因此父代病毒无法复制,载体本身只是将目标基因转移到靶细胞内的工具。

利用逆转录机制构建自我失活(SIV)的HIV-1来源的载体,一旦转移到靶细胞后,它就丧失了病毒长末端重复的转录能力,减少了产生重组病毒的机会,并避免了与启动子干扰的问题。以HIV-1 为基础的第3代慢病毒载体系统的安全性甚至超过了目前临床试验正在使用的致癌性逆转录病毒载体。

八、 结　语

迄今种种努力表明,在保证HIV-1 载体安全性的基础上,要产生有复制力的HIV ,必须在不同的质粒上发生多次非同源重组事件。总之,慢病毒载体在基因转导方面的良好特性,必将成为基因治疗的有力工具,值得进一步深入研究。