影响免疫印迹的背景问题

本底高和非特异性条带可能是由于抗体制剂中存在与印迹膜上其它蛋白质结合的抗体（非特异性抗体）。对于免疫印迹来说，理想的抗体应是仅能特异性识别待测抗原，但实情并非如此，印迹膜上总会出现一些额外的条带。

这些条带的来源一般有两种：一种是由于制剂中存在的非特异性抗体产生的背景条带，另一种则是由于特异性抗体与含有与待测抗原类似表位的多肽发生的交叉反应。

动物抗血清中含有各种各样的抗体，包括采集血清时存在于动物体内的全部抗体。其中有针对各种细胞成分的自身抗体以及针对侵入动物体内的微生物产生的抗体，这些保留在血液中的循环抗体既有新近产生的，也有在采血之前某个时间产生的。

除此之外，还有在免疫动物时污染的其它抗原刺激产生的抗体。这些抗体可与印迹膜上的同类抗原或密切相关的抗原结合产生额外的条带，致使特异性条带变得模糊不清。由于这种类型的污染是特异的，因此不可能用降低非特异性背景的一般方法来解决（例如，更广泛的封闭印迹膜或更彻底的清洗）。

（一）弥散性背景过高

1、若用间接检测技术，首先应考虑二抗是否与背景有关。观察省去一抗时，二抗单独作用所产生的背景。若背景由二抗产生的，可采用以下措施：A）缩短二抗的孵育时间；B）试用高浓度的蛋白质来吸附二抗。首先在二抗试剂内加入3%BSA。若背景仍然存在，再试用抗原制品的原液（用丙酮脏粉较好）；C）使用另外的二抗。

2、使用不同的封闭缓冲液。

3、若无别的选择，可尝试用5%脱脂奶粉/吐温。

4、滴定一抗和/或二抗的效价，找到一个产生的信号强度可以接受的较低浓度。

5、缩短一抗和二抗的孵育时间。

6、每一步都用RIPA缓冲液（1%NP-40，0.5%DOC，0.1%SDS，150mmol/L NaCl，50mmol/LTris，pH8.0）冲洗印迹膜。

7、在一抗和二抗试剂中加入1%NP-40或0.3%吐温和3%BSA。

8、延长每次清洗时间。

（二）非特异性背景条带

1、若用间接检测技术，首先应考虑二抗是否与背景有关。观察省去一抗时二抗单独作用所产生的背景。若背景条带是由二抗产生的，首先使用替代的标记试剂。其次，试用抗原制品原液吸附二抗。丙酮粉较为适合。

2、若使用单抗，可改用另一种单抗。但必需注意，若同一条带持续存在，说明待测抗原和其它条带之间存在氨基酸的同源性。

3、若使用多克隆抗血清作为一抗，可试用不含待测抗原的蛋白质制品吸附血清。