影响免疫印迹成败的两个因素

影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位的性质。只有那些能识别耐变性表位的抗体可与抗原结合。多数多克隆抗血清中或多或少地含有这种类型的抗体，所以在免疫印迹实验中常选用多克隆抗体。

相反，许多单克隆抗体不能与变性抗原反应，因为它识别的表位依赖于抗原蛋白正确折叠所形成的三维空间构象。表显示各种抗体的优缺点。

影响免疫印迹实施的因素是蛋白质原液中抗原的浓度。对于中等分子量的蛋白（例如，约50kD）其浓度需达到1/106 左右时，才易于检出。采用目前的技术，浓度低至0.1ng的蛋白亦可被检出。含量极低的蛋白在进行凝胶电泳之前要进行部分纯化，用免疫沉淀方法制备样品，能够扩大免疫印迹检测范围。

免疫印迹不需要高亲和力抗体。例如，某些在溶液中和抗原结合能力较弱的抗体，用于免疫印迹可获得满意效果，这是由于膜上局部抗原浓度较高。局部高浓度的抗原提供了较多的与抗体结合的机会，因此大大提高了相互作用的亲合力。

抗原密度也有利于将低亲和力的抗体保留在膜上。由于反应的频率增强，脱离膜的抗体可与临近的抗原位点重新结合。