家兔椎间盘(intervertebral disc )细胞的体外培养方法

Material and method：

Material :

1、培养皿、培养瓶、烧瓶、试管等。

2、分离组织需要的眼科剪子、眼科镊子。

3、5%CO2孵箱、PH计、95%氧气源。

4、36电动恒温水浴。

5、培养液、各种缓冲液及添加剂DMEM高糖培养基、Hank’s缓冲液 、20%胎牛血清，转换生长因子（TGF-β1）(5ng/mL)、胰岛素-转铁蛋白-硒（10ug/mL胰岛素，5ug/mL转铁蛋白，和0.5ng/mL亚硒酸盐）青霉素100U/Ml，链霉素100U/ml 。

6、消化液 胶原酶(collagenase) 200U/ml 0.4%台盼兰、0.25胰蛋白酶

Method 1 组织块法

1、取材：空气栓塞法处死家兔后，在无菌状态下获取家兔椎间盘组织。置于准备好的DMEM培养基（含双抗）。迅速带回到无菌超净台上。（注意事项：椎间盘位于相邻两个椎体之间，取材过程较为繁琐，要求动作迅速，争取在家兔死后半小时内完成，否则，该组织对缺氧耐受性差导致培养失败）。

2、剪切：在超净台上，进一步将周围组织分离，用Hank’s液冲洗数遍，直到冲洗液透明为止。眼科剪刀将组织修剪为1~2cm3大小的小组织块，Hank’s冲洗干净。 加入少量含血清的培养液。(组织块不宜过小，否则不容易爬出足够数量的细胞)

3、接种：用吸管吸取小组织块入培养瓶底部，摆放均匀，一个25cm2的培养瓶可放置10-15个小组织块，翻转培养瓶，加入少量培养液。4~6小时后，待组织块充分贴壁后，再翻转回来（动作一定要轻巧，以免刚刚贴壁的组织块脱离瓶底）

4、置于5%CO2孵箱中培养，每隔3天换液。待细胞95%融合时，0.25胰蛋白酶传代分瓶。

Method 2 消化法

前面步骤同组织块法1，2。

（3）组织块再进一步剪切，此时培养液中最好不加血清。完毕后，加入消化液，移入到10ml 离心管，培养箱内消化。每隔20分钟，用吸管吹打一次，观察液体有否变浑浊，并取少量液体，在相差倒置显微镜下观察。0.4%台盼兰染色计算活细胞数目。接种密度在105数量级。置于5%CO2孵箱中培养，每隔3天换液。待细胞95%融合时，0.25胰蛋白酶传代分瓶

Result:　IVD细胞为类软骨细胞，描述：单层细胞形状不规则，可呈三角形、多角形，梭形及不规则形。不同于成纤维细胞。附图：

组织块法

细胞传代前状态 95%融合