Co IP Protocol
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一 原理:
IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。
其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。
另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。
再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。
每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。欲速则不达,确定好比例很必要。
二 准备:
器械
微量高速冷冻离心机 移液枪 旋转盘 电泳设备 vortex震荡器 液氮及组织粉碎器 eppentube
试剂
细胞或组织 蛋白定量kit SDS电泳试剂 抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清) PBS NaN3 proteinA sapharose
试剂配制
抗原蛋白溶解缓冲液
1.RIPA缓冲液 (最终浓度)
1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)
5MNacl 15ml (150mM)
0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)
20%TritonX-100 25ml (1%)
10% DOC 50ml (1%)
10%SDS 5ml ( o.1%)
TLCK 18.5mg (0.1mM)
TPCK 35mg (0.2mM)
DDW 395ml
toal 500ml
另外,使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精,浓度100mM,-20度遮光保存。注意不易溶于水)
2.NP40 lysis 缓冲液
1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)
5MNacl 15ml (150mM)
0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)
20%NP40 25ml (1%)
TLCK 18.5mg (0.1mM)
TPCK 35mg (0.2mM)
DDW 450ml
toal 500ml
使用前加1mM的PMS
注意点:
~undefinedTris缓冲剂PH随温度变化,高浓度盐酸滴定时发热,冷却后PH增高。
~undefined反复使用PMSF要注意保管方法。
~undefined1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂,作用温和,,DOC ~undefined两方都有EDTA,对抗原而言,二价离子Mg,Ca等是必要的。根据自己需要调节。EDTA用NaOH滴定。