正常视网膜色素上皮细胞原代培养

实验材料：

1. 材料来源：人眼、兔眼或者猪眼等；

2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素，pH7.2；

3. 特殊取材器械：眼球托与7-0尼龙线。以灭菌的白色橡胶反口胶塞作为眼球托；

4. 消毒液：200IU/ml的庆大霉素生理盐水；

5. 消化液：0.01%EDTA-0.125%胰蛋白酶的混合消化液；

6. 培养液：为含10%胎牛血清的DMEM培养液；

7. 培养器皿：培养瓶、24孔培养板或培养皿若干。

实验方法：

1. 摘取眼球，用200IU/ml的庆大霉素生理盐水浸泡消毒5min。沿锯齿缘后2—3mm处环形剪开眼球前段，去除角膜、晶状体以及玻璃体。分离去掉视网膜神经上皮层。将眼球后段制成眼杯；

2. 将眼杯置于眼球托（可以洗净消毒过的盐水瓶胶塞替代）上，取持针器用7-0尼龙线在4个对称方向上，把眼杯缝合固定在眼球托的壁缘上；

3. 用毛细吸管轻轻从眼杯中吸出视网膜神经上皮层。以PBS液漂洗眼杯2次，吸干；

4. 加入0.01%EDTA-0.125%胰蛋白酶的混合消化液，置于无菌的烧杯中。于37℃恒温箱中消化30min；

5. 吸去消化液。用PBS液稍洗。加入有血清培养液终止消化酶的作用，并用毛细吸管轻轻吹打眼杯内壁，以使视网膜色素上皮细胞脱落；

6. 收集眼杯内的细胞悬液，离心（800r/min）8min；

7. 弃上清液，将沉淀的视网膜色素上皮细胞重新用培养液悬浮。计数；

8. 以8×104—10×104个/ml的密度接种于培养瓶中；

9. 送入培养箱中，按常规方法培养，每周换液2次；

10. 也可直接用机械分离植块法：用无齿镊撕下视网膜色素上皮细胞层，经PBS漂洗后，将其剪成1.5mm×1.5mm大小的组织块，直接接种于24孔培养板进行培养。