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以4-MU(四甲基伞形酮)为底物定量检测ß-半乳糖

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1 应用说明


编码β-半乳糖苷酶(Gal)的基因已商业化地运用到报告基因研究的各种层面,重组的β-Gal已得到成熟的运用,以此用来研究启动子的功能、组织特异性表达、发育调控、mRNA的稳定性以及各种细胞器靶向蛋白的信号序列。


应用β-Gal来测定启动子和基因的活性具有双重优点;检测方法简单,用于酶活性分析的底物容易获得,使用TBS-380微型荧光计对溶液中β-Gal活性进行检测时,其灵敏度和定量与荧光基质底物4-MU(四甲基伞形酮)相关。


2 应用原理


4-MU酯类只有裂解之后才能产生荧光。进行荧光素酶检测主要基于以下原理:首先要水解含有4-MU的底物,比如β-葡萄糖醛酸酶水解β-4-MU-葡萄糖醛酸或β-Gal水解β-4-MU-半乳糖。β-Gal水解4-MU-β-D-半乳糖产生的荧光分子4-MU,在365nm激发时能在460nm处产生发射光。


Turner BioSystems公司的TBS-380微型荧光计提供了灵敏而可靠的4-MU测定法。用标准10x10mm比色杯,TBS-380的线性检测范围为0.1nmol到750nmol或20 fg/mL 4-MU。微量检测皿适配器的灵敏度范围从1.0nmol到200nmol。


对15个稀释点三次重复测定的平均变量系数为3.5%。在4-MU检测中,重复测定中的变量应和光漂白及内在的波动相关。结果包括用微量检测皿和10x10mm比色杯的测量。

TBS-380微型荧光计的4-MU测定法


将4-MU系列稀释液的重复荧光检测结果进行平均、绘图。为了更高的精确度,用两个不同的校准值500nM和50nM产生了两个重叠曲线。两个曲线都显示有R2值,表明荧光值和4-MU浓度存在线性关系。TBS-380微型荧光计对4-MU的检测底线(MDL)是0.1nM,具有99.5%的可信度(Ziebold, 1967)。


3 所需器材


带有紫外激发模块的TBS-380微型荧光计 (P/N 3800-003) ;10x10mm荧光比色杯 (P/N 7000-959);微量适配器(P/N 3800-928),可选 ;微量比色杯(P/N 7000-950) ,可选;4-MU,钠盐,MW=198.20 (Sigma, P/N 1508);蒸馏水;无水碳酸钠,MW=105.99


4 4-MU溶液的制备


4.1 4-MU贮存液A(1mM):19.8mg 4-MU(钠盐),MW=198.20;加蒸馏水至100mL;4°C避光贮存


4.2 4-MU贮存液B(1mM):10 μL 4-MU贮存液A;加蒸馏水10mL;4°C避光贮存


4.3 碳酸盐终止缓冲液(0.20M):2.12g无水碳酸钠,MW=105.99;加蒸馏水至100mL


5 实验方案


为了检测报告基因中的4-MU,产生β-Gal的细胞需先裂解并和合适的底物共同孵育。商业化的β-Gal报告基因检测试剂盒通常会有处理方案、组织特异的信号增强子和重组酶。


大肠杆菌β-Gal在中性pH时活性最高,然而脊椎动物的β-Gal是溶酶体酶,在pH4.5的乙酸盐缓冲液中活性最高。孵育期缓冲液不会影响到TBS-380检测4-MU荧光值的灵敏度。


5.1 根据操作指导,将裂解细胞和4-MU底物共同孵育。所有样品同一时间内孵育,通常2min。


5.2 向100 μL细胞裂解液中加入1.9mL碳酸盐终止缓冲液,终止β-Gal的活性,从而制备检测样品。

(责任编辑:大汉昆仑王)

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