备择方案 用多肽底物

酪蛋白激酶 I 可用多肽 AspAspAspGluGluSerIleThrArgArg 进行分析，最近酿蛋白激酶 II 也已被特异性的多肽底物分析，如 ArgArgArgGluGluGluThrGluGluGlu（下划线残基是磷酸受体）。两个多肽均可通过精氨酸残基结合到 P81 磷酸纤维素膜上。第一个多肽对酪蛋白激酶 I 相对比较特异，但它的磷酸化反应动力并不理想，其 K_m 值大小在毫摩尔范围。因此只有在此酶的纯度很高时用于酪蛋白激酶 I 分析比较理想。

1. 每个分析反应按以下比例将各反应组分加入 1.5 ml 微量离心管中：

10 μl 5 × 酪蛋白激酶反应缓冲液

5 μl 10 mmol/L用于酪蛋白激酶分析的合成肽底物溶液

5 μl [γ-³²P] ATP溶液（ATP终浓度为5 μmol/L，放射活性为5 μCi/μl）

0~30 μl 水

盖好离心管，放入 30℃ 水浴温育 10 min。每个反应的容积为 50 μl，加入水的量取决于加入酶样品的量。

2. 加入 1～30 μl 有酪蛋白激酶活性的酶样品开始反应。

3. 30°C 水浴，10 min。

4. 按不同的分析目的和方法加入适当的试剂停止反应：20 μl 预冷 10 % TCA 进行 TCA 沉淀，或 10～20 μl 预冷的 2 × SDS-PAGE 样品缓冲液进行电泳分析。

可用 10 μl 的反应混合物点膜，使酶吸附在 P81 磷酸纤维素膜上。用那些方法中的一种继续进行分析。