酪蛋白激酶分析实验

β-酪蛋白（溶于水） 有酪蛋白激酶活性的酶样品
[γ-32P] ATP 溶液 酪蛋白激酶反应缓冲液 TCA SDS-PAGE 样品缓冲液
30℃ 水浴 P81 磷酸纤维素膜 离心管 离心机

1. 每个鉴定反应按以下比例将各反应组分加入 1.5 ml 微量离心管中：

4 μl 5 × 酪蛋白激酶反应缓冲液

1 μl 10 mg/ml β-酪蛋白

1 μl [γ-³²P] ATP 溶液（ATP 终浓度为 5 μmol/L， 放射活性为 5 μCi/μl）

1～14 μl 水

盖好离心管，混匀，放入 30℃ 水浴温育 10 min。

2. 加入 1～14 μl 有酪蛋白激酶活性的酶样品开始反应。

3. 30℃ 水浴，10 min。

4. 按不同的分析方法加入适当的试剂停止反应：加入 20 μl 10 % 的预冷 TCA 进行 TCA 沉淀，或 10～20 ml 预冷的 2 × SDS-PAGE 样品缓冲液进行电泳分析。用那些方法中的一种继续进行分析。

1. 对于 Cr 酪蛋白也可使用该反应混合物。每个反应的容积为 20 μl。在步骤 2 中加入水的量取决于所用酶样品的多少。

2. 加入酶量的容积取决于样品中酶活性的大小。在预试验中所得的最大反应值可衡量磷酸转移反应的程度。在反应中为了保持磷酸基与底物的线性结合关系可适当减小酶的加量。