核基质结合区修饰的附着体载体介导的EGFP基因体外表达
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非病毒载体介导的基因治疗有许多优点，但就目前大多数表达体系而言普遍存在外源基因表达水平低而短暂等问题为了使外源基因稳定持续表达，必须对质粒DNA 进行改造。
附着体质粒载体(episomal vector)可以使外源基因以附着体形式复制，分离到子代细胞，从而使基因高效持续表达，是种新型的非病毒表达载体 。
我们构建了以EB病毒(Epstein Barr virus，EBV)复制子(EBV replicon，EBVR)为基础的附着体质粒载体，并将报告基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein．EGFP)克隆至它的多克隆位点，观察其在COS-7细胞中的表达。材料与方法
试剂各种限制性内切酶；T DNA连接酶、无DNA酶的RNA酶和100 bp DNAMarker；Klenow酶；
Lambda DNA HindIll Marker；Trizol试剂、Taq DNA聚合酶和琼脂糖；酵母抽提物、胰蛋白胨；DNA凝胶回收试剂盒、质粒DNA分离纯化试剂盒；Lipofectamine 2000阳离子脂质体、Opti-MEM、DMEM培养基和M-MLV逆转录酶；小牛血清；G418；DIG High PrimeDNA Labeling and Detection Starter Kit I1。
采用Hindin和EcoRI消化pCL，获得800 bp的人13-IFN基因上游IFN-MAR，将此片段克隆至pBluescript中，构建重组质粒载体pBlue-MAR。再将MAR片段经SalI和XbaI双酶切插入pGL3-EBVR的EBVR片段下游，构建pGL3-EBVR-MAR。
经Hind Ill消化，Klenow酶补平，将5．3 kb的EBVR-MAR片段亚克隆入pcDNA3中CMV启动子上游Bgl I1与Ⅳ，MI位点之间，构建重组质粒载体pcDNA3-EBVR-MAR。
将聚合酶链反应(PCR)扩增所得的EGFP片段插入pcDNA3-EBVR-MAR的Hind11I和XhoI之间，得到重组质粒载体pcDNA3-EGFP-EBVR-MAR。经MfeI和EcoRI消化去除OriP片段，T 连接酶连接，构建得到重组质粒载体pcDNA3-EGFP-EBNA1MAR。
细胞株COS-7在含10％ 小牛血清的DMEM培养液、5％CO 、37℃ 恒温箱中培养。用阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导质粒pcDNA3-EGFP.EBVR和pcDNA3.EGFP.EBNA1.MAR转染细胞COS.7。
具体操作参照产品说明书。48 h后检测目的基因表达或以1：20传代后加入G418(400 g／mL)筛选，每2～3天换液1次。10～14 d后抗性克隆形成，分离并扩增各单克隆细胞。分别在转染后14、28、60 d检测目的基因表达。
3．逆转录(RT)-PCR检测EGFP cDNA转录：细胞转染后14、28、60 d采用Trizol试剂抽提细胞总RNA。具体操作参照产品说明书。DNase I孵育去除残留的基因组DNA，紫外分光光度计定量后，以GAPDH基因片段作为内参照，RT．PCR检测EGFPmRNA转录。
EGFP引物：上游：5’GCGAAGCTTCCATGGTGAGCAAGGGC 3’；下游：5’CCAGGATCCGCCGC 兀TACTTGTAC 3’；扩增片段长度为719 bp。
GAPDH 弓I物上游：5’TGGGGAAGGTGAAGGTCGG3’；下游：5’CTGGAAGATGGTGATGGGA 3’；扩增片段长度为233 bp。PCR扩增条件：95℃ 5 min后，94 ℃ 1min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min。
按照Hirt’S方法 在转染后14、28、60 d抽提COS．7细胞内小分子DNA。
具体方法：用10 mmol／L Tris．HC1(pH 7．5，1 mmoI／L EDTA，1％ SDS，200 g／mL Pro—teinase K)1 mL裂解5×10。个细胞，37℃ 保温2 h；裂解细胞液内加入5 mol／L NaC1 0．25 mL，轻轻混匀，4℃ 过夜；4℃ 离心，15 000×g 30 min；取上清，酚一氯仿抽提，乙醇沉淀，20 TE液(pH 8．0，10 mmol／L Tris—HC1，1 mmoI／L EDTA，25 g／mL无DNase的RNase)溶解。
为了鉴定获得的Hirt’S小分子DNA的完整性，取出5 μL，电穿孑L法转化大肠杆菌JM109，还原质粒。观察所得细菌克隆数，并挑取转化克隆质粒小量制备。以原始质粒作为对照，适当限制性内切酶酶切，0．8％ 琼脂糖凝胶电泳鉴定。
