Swiry
经典的miRna和靶基因的结合的位点是在3'UTR区,做双萤光素酶实验构建的载体是把3'UTR区序列克隆到萤火虫基因下游,也就是终止子后面,那如果要验证的是靶向序列在CDS区,是否也可以这么构建质粒?
毛利小五郎的徒弟
可以通过特异性cds序列进行结合位点验证
于小鱼鱼1998
可以用特异性cds区的引物连接上发光引物进行验证,产生特异性荧光就证明结合位点在cds区
loveliufudan
验证miRNA与靶基因CDS区结合位点的方法可以参考以下几点:
1. 如果仅验证miRNA与CDS区结合,可以将CDS区含目标位点的序列克隆到萤火虫素酶报告基因的3'UTR区,这种设计是可行的。
2. 更精确的方法是保留 CDS区在转录本中的位置,将CDS区target序列表达克隆到exon及intron区,萤火虫素酶基因作为独立的exon插入。
3. 也可以直接将整个靶基因CDS区连同上下游exon-intron序列克隆表达,保证目标位点位置和结构不变。
4. 除报告基因荧光检测外,也可以进行突变实验验证目标位点,如点突变、删除等。
5. 还需要进行miRNA过表达或抑制来验证miRNA的调控作用。
6. 最后可以进行Western blot检测靶基因蛋白水平变化,以进一步支持结论。
综上,验证CDS区位点需要保证目标序列在转录水平的位置和结构不变,荧光报告实验结合其他验证方法,可以得出较可靠的结果。
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