miRNA专家谈之二：如何绘制并验证表达谱
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Q1：你使用什么方法来确保灵敏而特异的miRNA 表达谱?为什么?
Galina Gabriely(哈佛大学)
我们通常利用多重定量PCR来对少量的人miRNA进行小规模图谱 分析。这种方法的灵敏度和特异性比芯片更好，因此在待分析miRNA数量不多时是首选。多重定量PCR图谱分析的准确性可用更加灵敏的单重分析来验证。
Peng Jin(埃默里大学)
我们一般采用miRNA TaqMan分析来确定特定miRNA的表达。我们尝试了多种方法，发现TaqMan的灵敏度和特异性更好。当然，在小RNA的数字表达谱上，我们也使用高通量测序 ，它与TaqMan分析有着很好的相关性。
Winston Kuo(哈佛大学)
我们已经使用过多种miRNA图谱 分析技术，包括Exiqon、Febit、High Throughput Genomics、Invitrogen和Luminex。Exiqon的microRNA芯片平台含有LNA寡核苷酸捕获探针。LNA是核苷衍生物，它提高了双链分子的解链温度。这大大改善了双链分子的热稳定性和特异性。LNA核苷的掺入还能实现捕获探针的Tm均一化。这对芯片的性能非常重要，因为miRNA很短，Tm差异大。Luminex的FlexmiR microRNA panel结合了Exiqon的LNA探针来实现高特异性。HTG则采用了互补的核酸酶保护探针与样品中的miRNA杂交，然后进行S1核酸酶反应来破坏错配的探针，非常灵敏。
Joshua Mendell(约翰霍普金斯大学)
在我们实验室，我们正在采用定制的芯片，主要因为它经济且易用。对于更高的灵敏度，也有好的选择，如Exiqon和Agilent的芯片及Applied Biosystems的TaqMan array。
Silvia Monticelli(瑞士生物医学研究所 )
在多年的northern杂交和点杂交后，我们越来越多地使用Applied Biosystems的miRNA TaqMan分析，它非常特异和灵敏，而且数据总是与northern blot很好地关联。
Q2：你如何验证表达结果?
Galina Gabriely(哈佛大学)
我们使用TaqMan microRNA assay的定量RT-PCR，并用其它稳定表达的miRNA来标准化数据。你也可以使用snoRNA来标准化。不管怎样，我们一般使用两个或三个不同分子来标准化，以确保可靠地预计miRNA的量。同时，为了确保结果可重复，我们会重复实验。
Peng Jin(埃默里大学)
通过早期不同分析形式的比较，我们发现miRNA TaqMan分析是非常可靠的。对于高丰度的miRNA，我们也用传统的northern blot来验证表达数据。
Winston Kuo(哈佛大学)
我们利用三种互补的策略验证表达结果：
1. qPCR：我们使用过两种方法，miScript SYBR Green System(Qiagen)和TaqMan miRNA assays(ABI)。我们倾向于前者，因为它含有poly-A加尾方法，回避了内源3’端miRNA序列多样性的问题。这种多样性是TaqMan茎环结构反转录引物策略的问题。从技术的角度，单个oligo dT的反转录反应(Qiagen)在费用、移液操作和可变性方面优于茎环结构的反转录。我们在384孔板上开展qPCR分析，每个处理组有四个样品和三次实验重复(总共12个孔)，以获得可靠、重复性好的结果。同时还包括无模板、无引物的对照。
2. Northern blotting：我们使用放射性标记的LNA寡核苷酸作为探针，进行miRNA的northern blot。许多miRNA在功能相关家族中发现，这些家族成员的种子序列为100%同源，只有3’端变化。因此，在使用qPCR或northern时，你必须验证分析只检测目的miRNA，而不是其它成员。我们在玉米(Zea)RNA载体背景中加入合成的成熟miRNA(IDT)来验证。
就northern来说，每个miRNA家族成员的合成miRNA在含有8M尿素的15% PAGE胶上进行。优化杂交温度，让LNA探针只与目的miRNA结合，而不与其它成员结合。一旦利用加标策略建立了适当的northern杂交条件，就能应用于实验样品。
3. 原位杂交：我们也利用Exiqon的DIG标记的miRCURY LNA microRNA检测探针，来确认我们的miRNA表达结果和组织特异性。
Joshua Mendell(约翰霍普金斯大学)
无论使用哪个平台，小心验证所有的芯片结果是很重要的。我们一般使用northern blotting(当我们有较多RNA时)，或者实时定量PCR(当RNA比较珍贵时)。我们发现只有操作正确，两种方法都能产生高质量的表达数据。Northern blotting比较便宜，但需要很多RNA，而定量PCR更灵敏，也更贵。
