miRNA专家谈之三：如何上调或下调特定的miRNA

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解读miRNA （MicroRNA）

miRNA 很小，这就增添了研究的难度。如何从细胞中提取和纯化miRNA?如何上调或下调特定的miRNA?如何验证结果?全靠自己摸索，体会是很深，但时间也花不少。以下是收集了来自顶尖研究院的专家的实际操作经验，这将让你少走弯路。

尽管第一个microRNA是在1993年发现的，但直到最近几年，人们才开始了解这种小RNA分子的大作用。miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达。最近的研究表明它们影响了约三成的基因。miRNA在多个组织中差异表达，这就让表达图谱 分析成为研究的重点。同时，miRNA的过表达和抑制也是近年来常用的研究方法。

然而，miRNA 很小，这就增添了研究的难度。如何从细胞中提取和纯化miRNA?如何上调或下调特定的miRNA?如何验证结果?全靠自己摸索，体会是很深，但时间也花不少。生物通收集了来自顶尖研究院的专家的实际操作经验，这将让你少走弯路。

Q1：您使用什么方法来上调或下调特定的miRNA ?为什么?

Galina Gabriely(哈佛大学)

对于miRNA 的下调，我们使用修饰的反义寡核苷酸，因为它们能产生最特异的抑制。此外，我们也使用LNA修饰的oligo。这些oligo与miRNA的高亲和力结合，提供了强的抑制，不过它们偶尔会有脱靶效应。对于上调，我们使用Ambion的合成miRNA模拟物。

Peng Jin(埃默里大学)

我们使用RNA oligo和载体的方法。对于RNA oligo方法，我们采用类似siRNA双链的miRNA，及anti-miRNA来增加或阻断特定miRNA的活性。这种方法便于操控细胞培养中特定miRNA的活性。

载体方法有着长期改变的优势，能够追踪个别细胞。我们利用人工的shRNA质粒或Pol II表达载体，来过表达特定的miRNA。对于miRNA的下调，我们要么表达一个shRNA，它能产生与miRNA前体的茎环结构互补的siRNA，要么使用miRNA海绵(miRNA sponge)，它能在特定miRNA的多个目标位点表达报告基因。

Winston Kuo(哈佛大学)

目前有两种通用策略：1) 基于载体或病毒的miRNA或miRNA反义链序列的过表达;2) 外源miRNA双链或反义抑制剂的转染。方法的选择取决于实验的设计。

一般说来，我们倾向于外源试剂的转染。载体/病毒的策略还依赖Drosha/Dicer酶对转录本的顺序加工，且必须通过Exportin 5从核中输出。在人类癌细胞系中曾报道过Drosha和Dicer水平的miRNA加工缺陷。此外，Exportin 5也被认为是细胞和小鼠模型中miRNA生物发生途径的瓶颈。外源过表达可饱和Exportin 5，从而胜过内源小RNA序列。极端的情况下会引起细胞或动物死亡。外源双链转染后，直接进入RISC复合物中，因而绕过了这些陷阱。

当然，在需要持久的功能获得或功能丧失时，还需要载体或病毒的稳定表达。稳定的细胞系必须小心地建立，采用病毒滴度测定来避免上述问题。

Joshua Mendell(约翰霍普金斯大学)

对于miRNA的上调，我们常常构建表达载体。制备起来非常简单。我们只是扩增miRNA发夹结构及一些侧翼序列，并直接克隆PCR产物。有时候，我们也用合成的miRNA模拟物来瞬时转染细胞，以过表达miRNA。

为了抑制miRNA，我们一般使用市场上的反义寡核苷酸。我们使用Dharmacon和Exiqon的抑制剂都获得了成功。这些试剂的局限在于它们只能瞬时作用。为了实现稳定抑制，我们开始用所谓的miRNA海绵。它们实际上是有着多个miRNA结合位点的捕获转录本，能隔离细胞中有活性的miRNA。

Silvia Monticelli(瑞士生物医学研究所)

我们主要使用慢病毒或反转录病毒系统，因为我们主要研究原代细胞，而且需要长时间的持续表达。取决于细胞类型，我们也使用lipofectamine或Amaxa来瞬时转染。对于下调，我们正使用miRNA海绵。对于短期研究，miRNA抑制剂的瞬时转染效果也很好。

Q2：如何验证miRNA上调或下调的结果?

Galina Gabriely(哈佛大学)

为了评估处理后miRNA的活性，我们测定了与miRNA结合位点融合的萤光素酶的表达。不过，评估miRNA活性的最佳方法是评估它的天然靶点的表达(如果miRNA靶点已知)。这可以通过western blot分析来进行。miRNA表达的调节可用northern blot分析来评估miRNA的表达水平。在某些情况下，定量RT-PCR也能给出miRNA表达的可靠结果，但miRNA调节所使用的寡核苷酸会在PCR反应中干扰引物，从而影响真实的表达数据。

Winston Kuo(哈佛大学)

我们使用几种策略，包括miRNA qPCR，miRNA northern blot，萤光素酶报告分析，mRNA靶点的qPCR，以及蛋白靶点的western blot。在上面我已经讨论了miRNA qPCR和northern blotting。这些能够直接检测miRNA过表达或下调。萤光素酶报告分析包括3’-UTR序列克隆在萤光素酶编码序列的下游。这些3’-UTR包含了人工的miRNA同源位点或已验证mRNA靶点的内源序列。后一个策略中的关键对照是生成假定同源位点上种子序列的点突变。这些点突变将使miRNA不能调节萤光素酶的表达。

Joshua Mendell(约翰霍普金斯大学)

为了验证miRNA上调，我们还是使用northern blotting或实时定量PCR来测定miRNA的丰度。测定miRNA的抑制就没那么简单。反义oligo确实降低了miRNA的丰度。因此，你也可以用同样的方法来监控miRNA抑制。不过，体内miRNA的隔离不会总是让miRNA丰度下降。另一个方法是用报告基因重组子来监控miRNA的抑制。miRNA会抑制报告基因的表达，除非它的活性受阻。当然，这种报告基因的使用一般受限于细胞培养环境。

Silvia Monticelli(瑞士生物医学研究所)

这些实验中的关键一步是：通过转染或转导细胞，你有效地改变了它们，因此你的确需要很多对照，来确认你所看到的结果是来自miRNA的表达或下调。这对miRNA尤其重要，因为在很多情况下，你并不期待一个强的表型，但是你在寻找微调基因表达的温和效果。我想你至少需要目的miRNA之外的miRNA和种子区域的突变体。我还推荐使用不同方法来设法获得相同的结果。