miRNA专家谈之一：如何高效地提取和克隆miRNA

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尽管第一个microRNA是在1993年发现的，但直到最近几年，人们才开始了解这种小RNA分子的大作用。miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达。最近的研究表明它们影响了约三成的基因。miRNA在多个组织中差异表达，这就让表达图谱 分析成为研究的重点。同时，miRNA的过表达和抑制也是近年来常用的研究方法。

然而，miRNA 很小，这就增添了研究的难度。如何从细胞中提取和纯化miRNA?如何上调或下调特定的miRNA?如何验证结果?全靠自己摸索，体会是很深，但时间也花不少。生物通收集了来自顶尖研究院的专家的实际操作经验，这将让你少走弯路。

Q1：你如何从细胞中高效分离并纯化miRNA ?

Galina Gabriely(哈佛大学)

对于miRNA的分离，我们一般采用TRIzol试剂，它通常用于总RNA的分离。这种方法足以从培养的细胞系中纯化miRNA。不过，如果是从少量或质量差的组织样品中分离miRNA，我们则使用Ambion的mirVana miRNA Isolation Kit。有了这个试剂盒，可通过总RNA提取 或小RNA /miRNA富集的步骤分离miRNA。

Peng Jin(埃默里大学)

我们一般采用TRIzol从细胞中分离RNA。对于从组织或细胞中回收小RNA，TRIzol非常有效。

Winston Kuo(哈佛大学)

总的来说，我们实验室采用几种方法，这取决于图谱 分析所使用的方法。TRIzol和Ambion的mirVana miRNA分离试剂盒都很有效。其他方法也很管用。对于某些技术，不需要分离或纯化;只需要直接加入裂解液。RNA样品制备的关键问题是有效沉淀小RNA组分。传统的使用70%乙醇洗涤的方法不能有效沉淀miRNA。将乙醇浓度增加到80%以上，就能解决这个问题。生物通 Joshua Mendell(约翰霍普金斯大学)

对于细胞和组织的表达分析，直接的总RNA分离方法就很好。我们一般使用TRIzol。根据我们的经验，不需要更复杂的过柱方法或进一步纯化小RNA。而且，在测定这些样品中的miRNA时，DNA污染似乎不是个问题。如果我们希望特定研究细胞中的小RNA群体，比如对小RNA文库进行测序，我们会对TRIzol提取出的总RNA进行胶纯化。Silvia Monticelli(瑞士生物医学研究所)

如果你的细胞或组织量没有限制，常规的TRIzol提取就已足够，质量和重复性都很好。我们一般将这种方法提取的RNA用于Northern blot和定量PCR，以检测miRNA，结果的重复性很高。如果你的起始材料有限，就有点棘手。你仍可以用TRIzol，但是需要改进RNA沉淀步骤。我们发现加入一些糖原，结果不错。另外，你也可以用Ambion的mirVana离心柱试剂盒来富集小RNA组分。

Q2：你如何有效克隆miRNA?

Peng Jin(埃默里大学)

它取决于克隆miRNA的目的。如果是miRNA发现或高通量测序，我们会使用5’和3’接头连接，来产生小RNA库。如果是已知的miRNA，我们想了解它的表达，一般会用PCR扩增包含目的miRNA的DNA片段，然后在适当的载体上验证它的表达。

Winston Kuo(哈佛大学)

在克隆miRNA时，有几个问题。如果你想克隆miRNA周围的一大段基因组背景(如上游启动子/增强子区域)，以了解内源转录调控和加工，可使用标准的PCR方法来生成带有酶切位点的miRNA片段，再克隆到载体上。如果你只是想克隆miRNA的编码序列，没有或很少侧翼序列，可以采用与shRNA相同的步骤。你只需要合成编码miRNA的oligo，上面含有适当的垂悬，退火之后与线性化的载体连接。当实验需要过表达，而不涉及内源转录/加工时，就常常采用这种策略。

Joshua Mendell(约翰霍普金斯大学)

为了从基因组DNA上克隆miRNA编码序列，我们通过PCR扩增pre-miRNA发夹结构及100 bp的5’和3’侧翼序列。这些片段能直接克隆到任何表达载体(有RNA聚合酶II启动子)上，并实现可靠的表达。

如果想直接克隆成熟的miRNA(比如说鉴定新的miRNA)，首先通过胶纯化从总RNA中纯化出小RNA。然后与接头连接，PCR扩增后直接用新一代测序技术(454、Illumina、SOLiD)来测序。