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    抗 体 可 变 区 （ V 区）的克隆、表达和修饰

    相关实验：抗体可变区（ V 区）的克隆、表达和修饰

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

    基本方案 1 通 过 使 用 冗 余 引 物 克 隆 和 表 达 免 疫 球 蛋 白 可 变 区

    注意：高压灭菌所有接触 RNA 的器械和容器，并用 DEPC 处理过的水冲洗。实验
    过程中一直戴手套。所有用于 RNA 的水和盐溶液都用 DEPC 处 理（附 录 1)

    材 料 （ 带7 项 目 见 附 录 1) 5X105 个来自能生产抗体的杂交瘤细胞株的细胞（ 单 元 1.3) V pbs 液氮，可选择的 V 异硫氰酸胍溶液 V 2mol/L 乙酸钠， pH4 V 水饱和的酚 49 : I (V/V ) 的氯仿/异戊醇 100%和 70% 0//V) 的乙醇，一20°C V 二乙基焦碳酸（ DEPC) 处理过的水 lmg/ml用于cDNA合成的3'端 引 物 （ 表 1.8.1) VcDNA第一链缓冲液 50U/V RNA 酶 抑 制 剂 （ RNasin; Promega) 10mmol/L 4dNTP溶于水的混合物
    表 1. 8.1 用 于 CDNA合 成 和 抗 体 序 列 的 扩 增 的 3'端引物 免疫球蛋白区域 PCR引物 引物序_列3 轻链恒定区 Oligo dT. Rl. XBA. H3 5’-GCCGGAATTCTAGAAGC (T )17^ 轻链恒定区 MCkAS. XBAb 5 ’-GCGTCT AG A ACTGGATGGTGGG AGATGG A-3 ’ 重链可变区 MgC. ChIASc 5’-AGGTCTAGAA (C yT) CTCCACACACAGG (A/G) (A ，G) CCAGTGGATAGAC- 3， a. 存在兼并性的核_ ff酸，已经在某位置用可替换的核苷指出。底下画截的是Xfe2I 克隆位点。 b. 能与鼠科动物K恒定•区的氨基酸122~116的编码序列杂交的序列。 c. 能与小鼠除IgG3 的免疫球蛋白中ChI 中的氨基酸13.0〜120的编码序列杂交的反义引物 9. 5U/ V1禽成髓性白血病病毒（ AMV) 反 转录酶（ Promega)，1/10稀释于反转录 酶 缓冲液（ 附录1) 2〇!wnol/L 针对小鼠的重链和轻链可变区的上游引物（ 表 1. 8. 2 和 表 1. 8. 3) 表 1.8. 2 扩 增 鼠 重 链 可 变 区 引 导 区 域 的 5'端正义引物 PCR引物_MHALT1._RV_MHALT2._RV_MHALT3._RV_MHALT4._RV_引物序列b 5 '-GGGG AT ATCCACCT AGGCA/G) ATG(C yG) AGCTG(T/G)GT(C， A) AT(C "GjCTCTT-S’ 5 '-GGGGATATCCACCTAG (A/G) ACTTCGGG(T/C) TGAGCT(T/G ) GGTTTT-37 5 ^ g g g g a t a t c c a c c t a g g c t g t c t t g g g g c t g c t c t t c t -s， 5 ^-GGGGATATCCACCTAGGC A/G) CAG (G/A)CTTAC(T/A)AT(C .T) (T/C)-3' a. 设计的Y端引物为可以同重链引导序列的氨基末端杂交的。所有引物同时应用，用于扩增未知序列。 b.EcaRV位 点 （ 画线处）被 V端的三个鸟嘌呤保护。核糖体结合位点用黑体表示。简并性核苷酸在某位置用 可替换的核苷标出。 PCR引物a MHALT1. RV MHALT2, RV MHALT3. RV MHALT4. RV MHALT5. RV MHALT6. RV 表 1 , 8 . 3 扩 增 鼠 轻 链 可 变 区 引 导 区 域 的 5'端正义引物 引物序列1 5 5 ^ g g g g a t a t c c a c c a t g g a g a c a g a c a c a c t c c t g c t a t -3; 5’-GGGG AT ATCCACC ATGGATTTTC AGGTGC AGATTTTCA03， 5^GGGGATATC CACCATG (G /A) AGTCACA(G/T) AC(T/C)CAGGTCTT(T/C) (G /A)TA-3’ 5 ^GGGGATATC CACCATGAGG (G/T) CCCC(A/T) GCTCAG(C/ T) TC. T() CT(T；G) GG(G/A)-3, 5 ^ g g g g a t a t c c a c c a t g a a g t t g c c t g t t a g g c t g t t g -s' 5/-GGGGATATCCACCATGATGAGTCCTGCCCAGTTCC-3, a. 设计的6 个引物为可以同鼠轻fe引导区域的氨基末端杂交的。所有引物同时应用，用于扩增未知序列。 b.EcoRV位 点 （ 画线处）被 5'端 的 3 个鸟嘌呤保护。核糖体结合位点用黑体表示。简并性核苷酸在某位置用 可替换的核苷标出 2U/M1 Tag DNA 聚合酶 I.25mmol/L 4dNTP溶 于 TE: 每种dNTP浓度为I.25mmol/L并溶于TE缓冲液 中， pH7.5 (附 录 1)。分装成Imi/支，在一20°C可以保存1 年。 V 10 XPCR扩增缓冲液 石蜡油 氯仿 T A 载 体 （ 见辅助方案；也可从Invitrogen购得） 第一章免疫应答导论
    I Weiss U/W T4 DNA 连接酶和 2 XT4 DNA 连接酶缓冲液（ GIBCO/BRL) 感 受 态 尺 〇 ^细 胞 （ 0?1附录3>0 2(Vmol/L J 区 引 物 （ 表 1.8.4) 表 1 . 8 . 4 扩增和克隆E 可变区的J 区引物 PCR引物 引物序列3 重链J区1 5 J hi JH 2 JH 3 JH 4 JH 5 轻链J区 VLJ 1，2,4 反 义 5^GGGGCTAGCTTACGTTTCT/G)ATTTCCA(G,A)CTT(G/T)GTCCC -3, VLJ 5 反义d，e 5’-GGGGCTAGCTTACGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC-3’ VLJ6 反义 S^GGGGCTAGCTTACGTTTCAATTCCAGCTTGGTG -3， a•简并性核苷酸在某位置用可替换的核苷酸标出。 b.NAeI位 点 （ 下画线处）用于克隆进人表达载体。 C .J« J ， L 2 * JK 4 的引物；不会引起氨基酸改变。 d.Sa/I 位 点 （ 下画线处）用于克隆进人表达载体。 ^ 九 5 和 JK 3 的引物是假基因。 用于PCR克隆的重链和轻链可变区的表达载体（ 图 1. 8. 2 和 图 1. 8. 3) 用于筛选的加入适当抗生素的LB平 板 （ CPI附录3N) 室温和4°C微量离心机 16°C 、42°C 、 60-C水浴 0. 5ml微量离心管 PCR仪 1•用微量离心机将5X105 个生产抗体的杂交瘤细胞在最大转速离心30s。弃上清，将 细胞沉淀重悬于Iml PBS中，重复离心。再 用 PBS洗一遍。如果有必要的话，将沉 淀迅速冻于液氮中，然后转移至一70°C 中备用。 2 . 在细胞沉淀中加人下列液体，每加一次都颠倒混匀，然后冰浴15min。 0 •5ml异硫氰酸胍溶液 50/^1 的 2mol/L 乙酸钠， pH4 0. 5ml水饱和酚 IOOmI 49 : 1 的氯仿/异戊醇 3_ 4°C ，最大转速离心20min 。将 上 清 （ 水相）层吸至另一干净的L 5mi离心管中。加 入 2 倍体积的一20°C无水乙醇沉淀RNA。样品在一7CTC孵 育 15min以 上 （ 最好过 夜） ，然后4°C ，最大转速离心l〇min。弃上清。 4•加入200fil —20°C 7 0 % 乙醇，短暂的混匀重悬沉淀，然 后 4°C ，最大转速离心 lOmin。弃上清，用乙醇再洗一次。晾 干 RNA沉淀或冷冻干燥1〜2min。将沉淀用
    图 1.8. 2 表 达 通 过 PCR克 隆 获 得 的 重 链 （ H) 可 变 区 （ V) 和 人 7 链 恒 定 区 （ C) 的 载 体 。填 充 的 黑 框 表 示 人 重 链 基 因 的 外 显 子 。选 择 性 限 制 性 内 切 核 酸 酶 位 点 在 图 上 多 接 头 位 置 内 标 示 出 ， 其 中 包 栝 EcoRV和 NZieI克 隆 位 点 ，外 显 子 下 方 的 箭 头 标 示 了 转 录 的 方 向 。表 达 载体在 位 点 被 线 性 化 ，用 来 表 达 人 基 因 序 列 3'端 的 另 一 个 SawH I位 点 也 已 标 示 出 。此 外 标 示 出 的 PwuJ位 点 位 于 Amp抗 性 区 内 ，通 常 也 可 用 来 线 性 化 表 达 载 体 。真 核 的 选 择 性 标 志 在 构 建图下 方 用 一 箭 头 标 示 ，箭 头 方 向 代 表 了 转 录 的 方 向 。小 鼠 非 编 码 区 用 点 描 的 线 条 表 示 ，启动子 的 位 置用细线条标7TC 。人 非 编 码 区 用 空 白 的 框 表 示 D 位 于 EcoRI克 隆 片 段 处 的 小 鼠 重 链 增 强 子 用 细 线 标 示 。 NAeI和 BamHI位 点 通 常 用 来 交 换 恒 定 区 。 2 0 fxl D E P C 处理过的水重悬。 5■加入9/xl R N A 到 2； xl浓 度 为 lmg/m l用于合成cDNA的 3 '端引物中，在 60°C孵育 lOmin。 将样品放在冰上冷却。开始cDNA合 成 反 应 （反应总体积为2〇^)。 第一条链cDNA缓冲液； Ijxl 50U/W RNA 酶抑制剂； 2jul 10mmol/L 4 种溶于水的dNTP混合物； Zfxl稀释过的禽成髓细胞瘤病毒（ AMV) 反转录酶。 42°C孵 育 I h 后立即用于PCR合成 cDNA或将其保存在一2〇 。(： 。 6.加 2/^1上述合成的cDNA和 5/xl合适的小鼠轻链或重链可变区引物至〇• 5ml的微量离 心管中，两种引物应等量。

    来源：丁香实验

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