非病毒载体介导的基因转移方法
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非病毒载体介导的基因转移方法
1)DNA―磷酸钙共沉淀法：磷酸钙共沉淀法是由Graham等人于1973年首先建立的。最早用于将外源基因转入培养的单层细胞，其机制可能是Ca2+
-DNA结合物形成的颗粒沉积在培养的细胞表面，导致细胞非特异性内吞。转染效率取决于沉积反应和形成颗粒的大小，对于不同类型的细胞其转染效率有所不同，目前仅用于体外培养细胞的基因转移。
2)直接注射法：将裸DNA直接注入单个细胞或组织内，分为显微注射法和注射法。显微注射法DNA转移效率高，准确快速，但转染的细胞数目有限，不适合大量细胞的转染，主要用于转基因动物的制备。注射法简便，但DNA转染效率低，常与下述电穿孔法联合应用。
3)电穿孔法(电脉冲介导法)：将细胞置于高压电场，借助高压短脉冲电流的作用使细胞膜出现瞬间微小的孔隙，这些微孔主要分布在靠近电极的细胞表面，从而提高细胞膜对外源DNA的通透性。DNA分子直接通过这些微孔，或者当微孔闭合时伴随膜组分的重新分布进入细胞质中。
电穿孔的基因转移效率很高，而且操作简便易行，因此这项技术广泛用于克隆化基因的瞬时表达。有报道电穿孔法可使大多数细胞系及一些原代培养细胞的瞬时转染效率达到90％。影响电穿孔法基因转移效率的因素主要有脉冲的最大电压、持续时间以及受体细胞的类型。
近年来电穿孔技术已经应用于活体基因转移，多种组织如皮肤、肌肉等都有利用电穿孔技术成功介导基因转移的报道。电穿孔可明显提高基因的转移效率，有研究报道对小鼠的骨骼肌细胞加一个脉冲电场，能使外源基因的表达量增加100倍。
最近在体内深部组织基因转移的应用也获得较大进展，如在活体视网膜基因转移方面的应用取得了较高的转染效率。
4)基因枪(微粒子轰击法)：是一种在高压电极作用下，与微小金颗粒或钨粉结合的DNA，瞬间穿透细胞的细胞膜，进入靶细胞、组织和器官的基因转移方法。微粒子进入细胞后，DNA逐渐从粒子中释放出来，开始表达。
基因枪技术具有操作简捷、安全、有效、不损伤靶细胞原有的结构等优点。最近多篇文献报道了使用内镜式基因枪将外源基因成功导人小鼠肝脏的例子。
5)脂质体转染法：非病毒载体中最具代表性的是阳离子脂质体(cationicliposome)，它具有可自然降解、无免疫原性等优点，已成为重要的体外基因转移介质。阳离子脂质体通常由一个单一的阳离子两亲化合物和一个中性脂质组成。
阳离子脂质体与DNA通过静电作用相结合，构成脂质体―质粒复合体。脂质体―质粒复合体通过脂质之间的相互作用，与靶细胞融合进入细胞内，分解并释放质粒DNA，最后DNA进入细胞核并在其中表达。
影响阳离子脂质体介导的外基因表达的因素较多，不同细胞、不同时间、不同结构及比率获得的转移效率可能不同。因此，应根据不同的细胞类型，选用不同的阳离子脂质体，通化阳离子脂质体与DNA比率提高转移效率。
脂质体转染法示意图 B：RNA路线；C：DNA路线
6)超声法：随着超声造影剂的问世，人们借助于超声与超声造影剂结合的DNA在靶组织与器官中释放并转染周围的组织细胞。超声法的特点是无创，并可作用于深部的组织和器官，是一种新型的基因靶向传输技术。
不仅超声照射本身可促进目的基因在体内外的转染与表达，而且超声介导的微泡造影剂依赖空化效应进一步增强基因的转染效率。超声介导的基因转染与超声照射的时间、超声波的频率、强度以及DNA的浓度有关。
