细胞凋亡的研究方法

Important notes：

Morphological data so far are most reliable and convincing evidence for apoptosis， especially with electromicroscopy

Morphological analysis should be included together with other parameters

Different methods may suit different cell types

The time-course of apoptotic events are important for selection of the methods

Flow cytometry is the most useful and powerful in apoptosis research

一、形态学研究方法 （Morphological methods）：

1、普通显微镜 ： 凋亡细胞变小、变形、细胞膜完整、发泡现象，晚期可见凋亡小体。
Giemsa 核染料：染色质浓缩、凋亡小体。

2、电子显微镜：细胞质浓缩、核变小、晚期核碎片成凋亡小体。

3、操作步骤 （Morphological methods）：

（1） 普通显微镜：将培养有细胞的24孔培养板于倒置显微镜下观察，观察经过诱导、和未诱导组的细胞形态、大小和细胞凋亡小体，照相记录。

（2）电子显微镜：5x106 细胞，加25%戊二醛固定，再用1%哦酸固定，将细胞置于丙酮：包埋基（1 ：1）中2小时，切片，透射电镜观察。可见细胞膜完整，核变小，染色质浓缩并结块/沿核膜内侧排列，晚期核裂解为碎片产生凋亡小体。

二、生物化学研究方法：

1、原理：染色质核小体单位 断裂 50~300kb，或180~200 bp整倍数片段（DNA ladder）。

2、设备：离心机、Agarose电泳装置，X-底片，照相系统

3、步骤：

（1） 5 x 106 细胞，加裂解液，离心，酚 / 氯仿提取细胞DNA，Agarose电泳，EB染色，拍照。

（2） 细胞量很少时，可用32P-ATP加脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）标记DNA，电泳、放射自显影，观察DNA ladder。

三、分子生物学研究方法：

1、TdT介导的缺口末端标记法（Terminal-deoxynucletidyl transferase mediated nick end labeling ， TUNEL）：

原理：染色质核小体单位 断裂 50~300kb，30% 酶切成180~200 bp片段，3’-OH缺口可在TdT作用下将标记有荧光素、生物素、过氧化酶等的核苷标记到3’-末端。正常细胞DNA很少断裂，很少被染色。

2、荧光素标记测定法：

（1）原理：地高辛-11-dUTP在TdT作用下 标记到3’-末端 。荧光素标记的地高辛抗体进行检测。可在激发光494 nm时产生523nm的发射光，可在荧光显微镜下计数或使用流式细胞仪进行定量。信号强度比正常细胞高28倍，比坏死细胞高10倍。

（2）特点：1.可测定早期凋亡细胞；2.可测定DNA发生断裂的时相； 3.地高辛/抗地高辛标记系统特异性好；4、适用于石蜡组织切片、冰冻组织切片，培养或分离的细胞的凋亡测定。

（3）设备：荧光显微镜/流式细胞仪，离心机，染色缸，水浴。

（4）步骤：将5x106 细胞加入1%副甲醛，固定15 min，离心，加70%乙醇，-20°C保存，洗涤，加TdT 2滴和50 ul 反应液。离心，洗涤，加100 ul荧光素标记的地高辛抗体，加1 ml碘化丙啶 （PI），染色15 min，流式细胞仪测定。荧光素标记的地高辛抗体可产生 523nm的发射光（绿色荧光），代表凋亡细胞；在620 nm处PI产生红色荧光，代表其余全部细胞数目。

四、免疫组织化学方法：

1、原理：染色体裂解成核小体DNA，并与组蛋白H2A、H2B、H3、H4 紧密结合，保护DNA。用抗组蛋白和抗DAN的抗体ELISA法，提高灵敏度并能测定早期凋亡细胞。

2、方法：抗组蛋白抗体包被酶标板，加入含有核小体的待测细胞裂解液，加入抗DNA 抗体-POD（可与核小体中的DNA结合），加底物DAB，酶标仪测定。

3、设备：试剂盒（Boehringer Mannheim），酶标仪，酶标板。