细胞凋亡研究方法的应用
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细胞凋亡研究方法的应用
以下将说明如何运用上述研究方法探索p53诱导细胞凋亡的机制。大多数肿瘤细胞都有p53基因的突变或功能丧失。携带野生型p53的细胞 中P53蛋白的水平很低，不足以引起细胞凋亡。因而，建立外源P53高水平表达的细胞系统对研究p53诱导凋亡具有重要意义。观察p53表达和激活引起的细胞生长停止或细胞凋亡，只能在p53基因可控表达细胞系中进行，如用四环素药物控制的p53表达系统。1990年，Michalovitz等报道了温度敏感型p53突变体p53-vall35。这种小鼠p53基因突变体的第135位密码子被突变为缬氨酸。在38~C，P53蛋白没有活性；在32~C，P53蛋白恢复野生型构象和功能。表达p53-vail35的细胞在非激活温度(37℃)时正常生长，而转移到激活温度(32C)后，细胞则停止生长或凋亡。1995年，Tsuchida等建立了人p53基因温度敏感突变体p53-vall38，并使p53-vall38在Jurkat细胞中和骨肉瘤细胞Saos-2中表达。当培养在激活温度时，Jurkat／p53-vall38(J138V)出现细胞凋亡，而Saos-2／p53-vail38则停止生长，但后者在特定生长条件下也可以发生细胞凋亡。
J138V细胞在非激活温度(37℃)培养时可正常生长，没有凋亡或细胞周期阻滞的表型。当j138V转移到激活温度(32~C)培养24h以后，用普通的相差显微镜可以观察到细胞形态的改变，包括细胞质的泡化。收集细胞并用Hoechst-33342染色后，在荧光显微镜下可以观察到凋亡细胞中局部染色质凝缩成为高度密集的区域，而37℃培养的n38V细胞则核染色浅而均一。细胞凋亡最富特征性的变化是DNase的激活，将DNA以核小体为单位切割为大小不等的片段。由于凋亡小体中DNA的含量少于正常2倍体细胞，用流式细胞仪分析凋亡细胞的DNA倍型时，会在正常的GO／G1期峰之前出现一小峰，称为亚二倍体峰(sub-G1)。sub-G1峰值的高低代表凋亡细胞在整个细胞群体中的比例。值得注意的是，凋亡的形态学特征会因为凋亡的刺激及细胞类型的不同而不同。
| p53诱导凋亡细胞的形态学改变 | Hoechst33342染色法显示p53诱导的染色质凝集 |
流式细胞仪分析显示p53诱导的sub-G1峰
各种刺激诱导凋亡大都是通过激活caspase来实现的，但不同的刺激其激活caspase的方式不同，被激活的caspase种类也有所不同。检测Caspase激活的方法有多种，最常用的是蛋白质印迹法检测Caspase前体酶的切割以及活性亚基的产生。不同caspase前体酶的大小不同，切割产生的活性亚单位大小也不同。caspase3前体酶为32 000，在激活过程中经过多步切割产生相对分子质量为17 000和32 000两个亚单位。但亚单位不稳定，不易检测。此外，不同抗体可能识别caspase的不同部位，要依据实验目的选择合适的抗体。
除了用蛋白质印迹检测caspase的切割以确定caspase的激活外，还可以直接检测凋亡细胞裂解液中caspase的活性。这一方法的原理是根据caspase对底物切割的特异性设计的。如caspase-8能识别切割底物IETD氨基酸序列。将细胞裂解液与带有生色团的四肽合成物IETD-AFC混合后，激活的caspase-8会切下荧光生色团AFC。游离的AFC被激发产生荧光，可用荧光分光光度计检测(激发波长400nm，发射波长550nm)。在caspase激活的链式反应中，不同caspase激活的先后顺序可用caspase的特异性抑制剂--四肽衍生物结合蛋白质印迹检测。如用caspase-8特异性阻断剂，则可以抑制caspase-3的切割和激活，则说明caspase-8是caspase-3的上级酶。但caspase抑制剂的特异性取决于抑制剂的浓度，在具体实验中要选择合适的浓度。
线粒体细胞色素C的释放是凋亡的重要指标之一。用免疫荧光染色法和线粒体分离结合蛋白质印迹法，可以检测线粒体中细胞色素C的释放。用类似方法也可检测Bcl-2家族蛋白的亚细胞定位。
