【原创】血液中直接PCR,无需DNA提纯

由于全血中存在有很多PCR反应抑制物，例如，血红素，蛋白质，盐，抗凝剂等，使得常规的Taq聚合酶不能从全血中直接进行PCR反应。因此，现在临床上往往先要从全血中提取DNA, 但即使这样，也不能完全克服上述抑制物的影响，这也是为什么目前临床上的DNA扩增反应，常常失败的原因

如果在遗传病诊断中，能够从全血中快速有效地进行DNA扩增，可以节省大量的人力，时间，费用，对临床遗传病鉴定，以及亲子鉴定是一个革命化的改进。

KAPA全血直接PCR：是世界上首个专门为全血PCR改造的高效DNA多聚酶。通过直接分子进化平台改造的，专门为从全血中扩增DNA而设计的多聚酶试剂盒中包括有2x 即用反应混合液，能直接从含有EDTA的全血中，或者含有血液的滤纸或 “Guthrie” cards上，来扩增出DNA,无需DNA提纯。

附：直接分子进化技术

1 什么是直接分子进化（Direct Molecular Evolution）?

直接分子进化又叫高通量分子进化（High-throughput Molecular Evolution）。是通过特殊的工程技术来对蛋白质进行改造，并制造出具有特定功能的蛋白质。

2 为什么要运用直接分子进化

目前生物医药领域所使用的大部分生物酶都只是天然存在形式，即使有些酶经过常规的蛋白工程方法来改造，但是由于酶分子自身的结构和功能限制，要想得到真正满足科研工作人员需要的产品，却是一件费时费力的事情，而且常常达不到预期的要求。

因此我们需要一种能在短时间内，改造出符合某种特定功能（比如，能够进行快速PCR的DNA聚合酶，或者对PCR抑制物有耐受性的DNA聚合酶）的生物酶。而直接分子进化就是为了满足这种需要而出现的高通量技术。

3 蛋白质改造工程的方法

为了进一步来了解什么是直接分子计划技术，以及其强大的功能和作用，让我们先来看看基于直接进化的蛋白改造和常规蛋白工程改造法的区别

常规蛋白改造的步骤：

A. 已知蛋白质的结构和功能

B. 通过计算机来找出重要的氨基酸，来模拟出这些氨基酸的改变，可能对蛋白质结构所造成的变化。

C. 通过点突变得到包含有这些氨基酸改变的蛋白质，然后测试该蛋白质是否有实验者所预测出的某种功能的改变。

显而易见，这种常规的方法具有以下的缺点：

A. 首先要知道蛋白质的晶体结构，而已知结构的蛋白质只占全部蛋白质的一小部分。即使已知蛋白质的机构，这种晶体结构也只是一个粗率的结构。

B. 计算机的模型化本身就是一种不精确的过程。

C. 只能对一个，或很少的几个氨基酸来做变异，而不能对多个变异的协同作用来进行预测。

D. 周期长。通过上述过程得到目的蛋白质，大约需要2-3年的时间。大大限制了使用高通量方法在蛋白改造工程中的应用。

4 为什么叫直接分子进化？和自然进化的区别

以直接分子进化技术为基础的蛋白质工程改造，是通过高通量途径，在短时间内得到具有特定功能蛋白质的一种方法。在自然进化中，进化压力来自于环境选择。只有那些能适应某种特定环境的变异才能生存下来。这个过程需要几百年，甚至成千上万年的积累。

直接进化技术正是针对这一现实情况，运用遗传，基因工程，生物信息学等技术来在分子水平上,设计真正满足不同实际要求的生物酶。

在实验室中，进化压力来自于试验本身，大大缩短了时间，可以在很短时间内（2-3个月）来生产出满足实验者个性化的要求。因此，和自然进化相比，我们称之为直接分子进化。

5 直接分子进化的成功关键是什么？

直接分子进化成功与否的保证是必须要有一个高效能的筛选技术。一般的文库有108个变异株，而现在世界上最先进的实验室也只能筛选104个，因此会遗漏掉一半的变异株筛选。如果要完全筛选文库里全部的变异株，那么就要建造一个更大的，并且很昂贵的实验室。这在目前的情况下，完全不现实。

这个瓶颈问题可以很容易地通过KAPA Biosystems公司的乳状液膜技术（Emulsion Technology）来实现。

其技术核心是在一个1ml的试管中，将含有表面活性剂和膜溶剂的油相和水相(内水相) 置于容器中,在高速搅拌下制成油包水型乳状液,再将此乳状液分散到另一种水溶液(第3 相)中, 就得到了水包油再油包水型乳状液膜。当乳状液分散到第3 相时,形成数亿万记的乳珠。

这样，每个乳珠就变成了一个小的PCR反应室，实现高通量的目的。再通过KAPA专利技术来筛选出具有特定功能(比如，快速，或者超强PCR)的DNA聚合酶。

和体积庞大的机械手相比，该技术的筛选过程是在1ml小试管中完成。能够完成对文库中所有变异株的筛选（>108）。在这个基础上，经过几次循环，就可以得到具有特定功能的聚合酶。