转座子标签法克隆基因的改进

1 转座子及转座子标签法克隆基因

基因标签法克隆植物组织中的基因是较为常用的一种方法，T-DNA和转座子均可作为基因标签。

转座子最早由美国的细胞遗传学家Mc-clintock在玉米中发现，它是指基因组中一段特定DNA片段，能在转位酶的作用下从基因组的一个位点转移到另一个位点。转座子不仅能在本基因组中转座，也能转入其它植物的基因组中。

转座的结果是使被转入的基因失活，从而有效地诱导产生表型突变株。然后构建一个对应于突变株的基因库，用作标签的转座子作为探针从基因库中筛选相对应的克隆，分离得到相对应于变异的基因，这就是转座子标签克隆基因。

玉米的Ac/Ds转座子家族是研究较为深入的植物转座子。

2 Ac、Ds转座子作基因标签时遇到的问题

2．1 Ac属于自主性转座子，自己能编码转位酶，因此可直接用于基因标签。但是由于Ac能自由地在基因组中转座，结果使转座产生的变异不稳定，给确定和分析突变基因带来困难。

2．2 Ds属非自主性转座子，本身不能编码转位酶，必须依靠Ac转座子产生的转位酶才能产生转座，因此Ds只有和Ac联合使用才能做为基因标签。

2．3 Ac和Ds联合使用后遇到的问题是Ac本身的转座成为除Ds之外又一个转座因素，因此产生突变后，要首先经过遗传分析确定突变因子是哪一个转座子，才能用探针进行筛选克隆，这就增加了分离基因的难度和工作量。

另外，Ac和Ds同时存在情况下，Ds能在Ac产生的转座酶作用下频繁转位，难以产生稳定的突变，这又产生了与Ac单独使用时存在的问题。

2．4 由以上分析，转座子Ac和Ds联合使用时必须从两方面进行改进：首先，如何使Ac稳定下来，即只有产生转位酶的能力而无转座的能力，从而减少产生突变的转座子种类。

此外，如何使Ds转座后，将产生转座酶的Ac分离，从而使Ds稳定下来，不再转座，使产生的变异得到稳定。人们对Ac、Ds进行改进后，发展了一种称为sAc/Ds的双系统法。

3 sAc/Ds双系统法

3．1 对Ac的改进 Ac是一段长约为4.5kb的DNA片段，人为将其末端转位必须的一段DNA序列切除后，它就不能再借助于转位酶进行转位，但仍能正常编码转位酶，这种修饰后的Ac称为稳定的Ac(StableAc，sAc)。

sAc产生的转位酶量可由放在转位酶基因之前的启动子控制，从而控制Ds在基因组内的转位频率。如果用Ac本身的启动子，其作用较弱，产生的转位酶少，Ds转座的频率较低，转变产生的突变就比较稳定。

如果用强启动子，则转位酶活力高，Ds转位频繁，产生的变异频率较高。同时为了筛选sAc的转化株还需要在Ac上克隆一个标记基因。用于sAc/Ds双系统法中sAc的构建方法略。

3．2 对Ds的改进 对Ds改进的目的有两个：第1，能方便地检测Ds是否已经从原位置转座；第2，能检测到Ds是否已转移到基因组的另一个位置。改进的方法是首先将Ds克隆到一个标记基因的启动子和密码子之间，这样可以通过筛选对抗生素的抗性来检测Ds是否已经转座。

另外在不影响Ds转座能力的前提下，在Ds的DNA序列中间克隆上另一个标记基因，这个基因将与Ds一起转座，这样就可以筛选对这一基因的抗性来检测Ds是否已经转座和转座的位置。

3．3 sAc/Ds双系统法克隆基因的原因及步骤

1)将sAc和Ds分别与T-DNA连接，在农杆菌的帮助下分别转入植物中，获得sAc的转化植株和Ds的转化植株。2)将sAc转化株与Ds转化株杂交，挑选同时含有sAc和Ds的子一代植株。

3)杂合植株中，Ds在sAc产生的转位酶帮助下转座，引起某个基因突变，从而产生表型突变株。

4)通过突变植株的自交和回交，选择仅含有Ds而无sAc的植株，从而使变异得到稳定。建立对应于变异株的基因文库或cDNA文库。

5)用IPCR的方法扩增与Ds相邻的DNA片段，利用此片段作探针直接从基因文库或cDNA文库中筛选对应的基因克隆，通过DNA测序和比较了解该基因的特征。

6)稳定的变异株再与sAc转化株杂交，使得Ds再次转位，使突变的基因得到恢复，从而得到回复突变株，用于检验所得到的基因是否对应于变异的基因。

4 sAc/Ds双系统法的应用

用sAc/Ds双系统法克隆基因，容易得到回复突变株和容易产生再次突变克隆其它基因，与T-DNA做基因标签相比省去了再次转化的繁琐程序，为克隆基因的工作带来了极大方便。

理论上用sAc/Ds双系统法克隆基因如果有足够的转化株，能克隆到任何一个基因，另外这种方法还可用于定点突变。如果对某一基因我们不知道它的表达产物，也不知道它何时在何部位表达，sAc/Ds双系统法是一种较好的克隆基因的方法，该方法以其独特的优点在克隆基因工作中将得到更广泛的应用。